五月婷网站,av先锋丝袜天堂,看全色黄大色大片免费久久怂,中国人免费观看的视频在线,亚洲国产日本,毛片96视频免费观看

　　轉(zhuǎn)染(transfection)是細(xì)胞在一定條件下主動或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對于哺乳細(xì)胞蛋白的表達(dá)至關(guān)重要，轉(zhuǎn)染的方法和步驟直接影響著轉(zhuǎn)染的成功與否。
 

　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑適用于24孔板培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞，所有數(shù)量和體積均是按孔計算。大部分細(xì)胞系所使用的DNA(μg)與VigeneFection(μg)的比值為1:3或1:4，轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的細(xì)胞可獲得高轉(zhuǎn)染效率、高表達(dá)水平和低細(xì)胞毒性。轉(zhuǎn)染步驟：
 

　　1、貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天每孔0.5-2×105個細(xì)胞接種于500μl培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)染時細(xì)胞可長至90-95%融合。
 

　　懸浮細(xì)胞：在配制轉(zhuǎn)染液前每孔4-8×105個細(xì)胞接種于500μl培養(yǎng)基中。
 

　　2、轉(zhuǎn)染液制備，每孔細(xì)胞用量如下：
 

　　A. 用50μlDMEM培養(yǎng)基(或者其他無血清培養(yǎng)基)稀釋質(zhì)粒DNA，輕輕混勻。
 

　　B. 取適量VigeneFection 在50μl DMEM培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5min。
 

　　C. 將前兩步所稀釋的DNA和VigeneFection 混合，輕輕混勻，室溫放置30min。
 

　　3、在每孔細(xì)胞中加入混合后的轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻。
 

　　4、貼壁細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染4-6h后可更換培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染后的18-48h之間，對細(xì)胞進行換液。轉(zhuǎn)染18-48h之后可檢測基因表達(dá)。如果檢測到蛋白表達(dá)，請在轉(zhuǎn)染后24-72h收集培養(yǎng)液。
 

　　5、對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24h后以1:10傳代培養(yǎng)，第二天可加入選擇培養(yǎng)基。
 

　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑將外源核酸片段導(dǎo)入細(xì)胞，影響內(nèi)源基因表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)染實驗前應(yīng)根據(jù)實驗要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑，例如在綿羊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中FuGene HD的轉(zhuǎn)染效率更高，GenEscortTM I對小鼠膠質(zhì)細(xì)胞則具有更好的轉(zhuǎn)染效果。總之，可以遵循低毒等原則進行選擇。在一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率與質(zhì)粒/轉(zhuǎn)染試劑比值成正相關(guān)，但毒性也會增加?？梢愿鶕?jù)轉(zhuǎn)染試劑推薦比例確定合適的合適的轉(zhuǎn)染比例。