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循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）分析已成為一種重要的臨床有用的癌癥診斷和治療監(jiān)測工具。然而，ctDNA檢測由于DNA濃度低，所以在技術(shù)上難度大且實驗情況復(fù)雜。這篇文章中，科學(xué)家們描述了其在Ion Torrent 測序平臺上新開發(fā)的一種高靈敏度的ctDNA檢測方法，被稱之為基于雜交和標(biāo)簽技術(shù)的錯誤校正測序（HYTEC-seq）。該方法結(jié)合了雜交捕獲和分子標(biāo)簽，以及新型variant caller PlasmaMutationDetector2以消除背景錯誤?？蒲屑谊U述了使用已知突變的對照樣本用HYTEC-seq檢測未知突變時，分析靈敏度高。此外，為了證明這種方法在臨床中的實用性，科學(xué)家分析了44例晚期胰腺癌患者的血漿樣本，發(fā)現(xiàn)57%的患者存在突變，等位基因頻率低至0.23%。文章發(fā)表在NATURE scientific report期刊。

圖 1 （A）HYTEC-seq實驗流程 （B）原始測序reads、單鏈一致序列（SSCSs）和HYTEC-seq測序的每個目標(biāo)位置的測序錯誤（替換）的相對百分比 （C）三種方法的總體錯誤率

實驗方法
· 樣本制備和cfDNA提取
整個實驗中，科學(xué)家選取了四個細胞系和60個健康人的樣本，也檢測了44個病人的血漿樣本。實驗采用50ng Multiplex I cfDNA Reference Standard Set（Horizon）作為標(biāo)準(zhǔn)品驗證HYTEC seq的可靠性。將患者和對照組的外周血收集到EDTA管中，并進行淋巴細胞梯度離心，將血漿在17000×g下離心10 min，去除細胞殘余和剩余血小板。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen)從血漿中提取cfDNA。提取后的cfDNA儲存在-80℃待用。

· HYTEC seq 文庫設(shè)計和構(gòu)建
該文庫使用Y型接頭適用于Ion Torrent測序平臺，帶有Ion Torrent 平臺的A和P1接頭序列，樣本條形碼序列，和用于錯誤糾正的分子標(biāo)簽。具體操作如下:
· 將20µL兩種新型的100µM P1和A接頭寡核苷酸序列在50µL的反應(yīng)體積中分別退火
· 使用PCR儀將接頭寡核苷酸體系加熱到97.5°C，持續(xù)150s
· 關(guān)閉儀器，等待1小時讓接頭復(fù)性
· 將復(fù)性后的接頭根據(jù)cfDNA加入量用dd水稀釋待用

樣本DNA采取酶打斷法至160pb的片段，并使用磁珠進行富集。片段長度由安捷倫2100生物分析儀進行質(zhì)控（High Sensitivity DNA kit）。文庫制備采用建庫試劑盒搭配安捷倫的靶向捕獲系統(tǒng)，采用了胰腺癌中常見突變的8個基因的靶向捕獲panel。捕獲到的DNA經(jīng)PCR擴增后由磁珠富集。最終文庫由安捷倫2100生物分析儀質(zhì)控。

在這篇測序方法開發(fā)的研究中，安捷倫2100生物分析儀又一次展現(xiàn)了其在核酸質(zhì)控領(lǐng)域的強勢地位?？蒲屑覀兪褂玫?100生物分析儀主要原理芯片式毛細管電泳結(jié)合微流控技術(shù)，操作簡單，檢測靈敏度高。在本次研究中老師選擇的High Sensitivity DNA kit，擁有很高的 DNA 分析靈敏度，適用于低至 5 pg/µL 的片段分析，或低至 100 pg/µL 的 NGS 文庫等復(fù)雜 DNA 樣品分析。文中提到的其他試劑耗材以及安捷倫2100生物分析儀配套的現(xiàn)貨試劑詳見下表，各位老師走過路過不要錯過！