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單細(xì)胞RNA測序技術(shù)（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）已被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究中，通過從單細(xì)胞水平解析免疫細(xì)胞亞群異質(zhì)性，極大地促進(jìn)了我們對免疫相關(guān)亞群的理解。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells, Treg)是控制免疫穩(wěn)態(tài)*的細(xì)胞，具有治療自身免疫的臨床潛力。通過研究得知體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，一些條件會(huì)使部分Treg失去Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而獲得效應(yīng)T細(xì)胞(Teff)的特性，這一過程被稱為Treg可塑性。免疫應(yīng)答過程中這種可塑性的程度和可逆性尚不清楚。今天向大家分享一篇近期發(fā)表在Science immunology（IF 17.727）上，利用scRNA-seq鑒定Unstable Treg亞群相關(guān)研究的文章“Unstable regulatory T cells, enriched for naïve and Nrp1neg cells, are purged after fate challenge”。

技術(shù)亮點(diǎn)
1.BD Rhapsody單細(xì)胞多組學(xué)分析系統(tǒng)
2.Rhapsody 靶向mRNA & AbSeq擴(kuò)增試劑盒（TTA）
3.BD Abseq寡核苷酸偶聯(lián)抗體
4.BD Rhapsody小鼠多樣本標(biāo)記試劑盒（SMK）
5.BD Rhapsody Analysis Pipeline

研究結(jié)果

1.體內(nèi)微生物生理刺激對ex-Foxp3細(xì)胞無誘導(dǎo)作用

研究者在本文中通過構(gòu)建遺傳誘導(dǎo)命運(yùn)圖譜小鼠技術(shù)(圖1A)驗(yàn)證ex-Foxp3的產(chǎn)生（圖1B），在微生物/抗原暴露下，無特定病原體的小鼠（SPF）與野生型小鼠（Co-house）體內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生數(shù)量相近、性能一致的ex-Foxp3細(xì)胞（圖1C-J）。

 
2. 發(fā)現(xiàn)ex-Foxp3細(xì)胞是Treg中的一群unstable Treg亞群

通過遺傳誘導(dǎo)命運(yùn)圖譜小鼠過繼轉(zhuǎn)移模型驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ex-Foxp3細(xì)胞是Treg中的一群unstable Treg亞群（圖2A，B，D），會(huì)在免疫缺陷的狀態(tài)下轉(zhuǎn)化生成(圖2F)
 

圖2 Ex-Foxp3細(xì)胞的形成是非隨機(jī)事件，體內(nèi)unstable亞群清除后Treg的穩(wěn)定性升高

3. Ex-Foxp3細(xì)胞對Treg表達(dá)的譜系無命運(yùn)記憶
 進(jìn)一步通過體外Treg極化條件下培養(yǎng)ex-Foxp3細(xì)胞（圖3A，B）、以及通過改進(jìn)的遺傳誘導(dǎo)命運(yùn)圖譜小鼠過繼轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證（圖3C-F），發(fā)現(xiàn)該ex-Foxp3細(xì)胞會(huì)持續(xù)保持炎癥效應(yīng)，而且對Treg表達(dá)的譜系再無命運(yùn)記憶（圖3）。

圖3 在體外和體內(nèi)，ex-Foxp3細(xì)胞表現(xiàn)出有限的命運(yùn)記憶

4. 單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)鑒定潛在的Unstable Treg亞群

BD Rhapsody單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)：TTA（214）+Abseq（5）+SMK

即使損傷改善后、炎癥環(huán)境消除，ex-Foxp3細(xì)胞炎癥狀態(tài)也會(huì)持續(xù)存在，所以能表征出這個(gè)原始異質(zhì)性的Treg亞群很重要。

基于流式技術(shù)獲取的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，研究者評估了Foxp3缺失前Tregs基因表達(dá)的變化, 選取Tregs (未處理的Foxp3YFP-CreRosaRFP 命運(yùn)圖譜小鼠中獲取的CD4+ YFP+ RFP+細(xì)胞)和將Foxp3YFP-CreRosaRFPTregs和同源naïve T細(xì)胞共轉(zhuǎn)移到Rag1KO（免疫缺陷型）小鼠體內(nèi)后在第5, 10, 和 15天獲取 CD4+ YFP- RFP+ ex-Foxp3細(xì)胞(圖4A和圖S10A)。降維聚類(UMAP)分析產(chǎn)生6個(gè)細(xì)胞亞群(圖4B)。Foxp3基因在所有ex-Foxp3細(xì)胞群體中均無表達(dá)，與分選報(bào)告相對應(yīng)(圖4C)。依據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)了三大類基因:快速丟失基因（Treg相關(guān)marker）、瞬時(shí)富集基因（穩(wěn)定性喪失中起主要作用的基因）和后期富集基因（高度激活的表型相關(guān)基因）(圖4D)。

圖4（A-E） 單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)鑒定潛在的Unstable Treg亞群

為了深入了解不穩(wěn)定Treg亞群的起源，研究者進(jìn)行了基于Pearson相關(guān)關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)分析(r 0.95)，以識(shí)別第0天與第5天ex-Foxp3細(xì)胞最相似的Treg(圖4F)。Inter Treg被確定為富含Unstable Treg的候選亞群，該亞群表達(dá)了88%的Treg特征基因，因此Inter Treg群體仍然代表真正的Treg。

圖4（F） 單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)鑒定潛在的Unstable Treg亞群

Inter Treg富集了naïve Nrp1- Treg(圖4G)，流式細(xì)胞儀顯示類似，脾臟naïve細(xì)胞富含Nrp1- Treg (圖4H)。在22%的第0天Treg中檢測到Nrp1的表達(dá)（依據(jù)共表達(dá)基因?yàn)榛A(chǔ)，可推斷出占群體的89%），只有13%的Inter Treg細(xì)胞和7%的第5天ex-Foxp3細(xì)胞中檢測到Nrp1 (圖4I)。然而，在Inter Treg亞群中分為Nrp1+和Nrp1neg兩組，Nrp1+和Nrp1-細(xì)胞與第5天ex-Foxp3細(xì)胞的關(guān)聯(lián)性都很高，而與第10天ex-Foxp3細(xì)胞的關(guān)聯(lián)性很少(圖4I右圖)。第5天ex-Foxp3細(xì)胞表達(dá)高水平CD62L(圖4E)。在所有Inter Treg差異表達(dá)的基因Nrp1在CD62Lhigh部分中特異下調(diào)?？傊?，這些數(shù)據(jù)提出了一個(gè)假設(shè)，naïve Nrp1- Treg是異質(zhì)性Treg細(xì)胞群中存在的亞群，在淋巴細(xì)胞降低的環(huán)境下最容易轉(zhuǎn)化。

圖4（G-I） 單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)鑒定潛在的Unstable Treg亞群
 

5. 淋巴細(xì)胞減少后pTreg和tTreg中unstable Treg亞群分析

Nrp1表達(dá)缺失被認(rèn)為是外周誘導(dǎo)的Tregs (pTregs)富集的原因。通過BAC-Foxp3Cre-GFP改進(jìn)的遺傳誘導(dǎo)命運(yùn)圖譜小鼠過繼轉(zhuǎn)移模型, 將Treg亞群作為一個(gè)整體進(jìn)行流式分選：BAC(GFP)+ Foxp3(Thy1.1)+亞群(tTregs，胸腺來源型Tregs)；BAC(GFP)- Foxp3(Thy1.1)+亞群(pTregs，外周誘導(dǎo)型Tregs)（圖5B）。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與tTregs相比，pTregs中富含unstable Treg（圖5C）?；罨癄顟B(tài)不影響Nrp1- Treg的不穩(wěn)定性（圖5E）。但從ex-Foxp3細(xì)胞群形成的絕對數(shù)量來看，這兩個(gè)Treg來源的ex-Foxp3百分比幾乎貢獻(xiàn)值同等(圖5F)，并且tTreg部分的不穩(wěn)定性可能主要源于早期和不*確立的新的胸腺轉(zhuǎn)移細(xì)胞（RTE）Treg（圖5D）。

圖5 淋巴細(xì)胞減少后pTreg和tTreg中unstable Treg亞群分析

單細(xì)胞多組學(xué)平臺(tái)
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 單細(xì)胞多組學(xué)分析系統(tǒng)能夠?qū)Τ汕先f個(gè)單細(xì)胞的蛋白與基因進(jìn)行數(shù)字定量，提供靈活的定制化Panel及標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用方案，以滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求，其*的混樣技術(shù)可有效節(jié)約時(shí)間與成本。

系統(tǒng)組成包括：
BD Rhapsody™ 掃描儀
BD Rhapsody™ 上樣臺(tái)
BD Rhapsody™ cartridge（微孔板）   
分子標(biāo)簽試劑和文庫制備
全轉(zhuǎn)錄組檢測試劑盒/靶向RNA檢測試劑盒/定制試劑盒
Abseq蛋白檢測試劑盒
多樣本混樣檢測試劑盒
VDJ檢測試劑盒
單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析軟件BD SeqGeq