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mRNA的xinguan疫苗的成功，離不開(kāi)幾十年來(lái)對(duì)脂質(zhì)載體給藥系統(tǒng)的研究。該技術(shù)已被用于向目標(biāo)細(xì)胞和組織傳遞各種生物活性分子，如小分子抑制劑和疫苗成分。脂質(zhì)載體技術(shù)與傳統(tǒng)的藥物傳遞方式相比有很多優(yōu)勢(shì)，包括增加藥物的穩(wěn)定性、生物利用度和分布。 

脂質(zhì)納米顆粒(Lipid nanoparticles，LNPs)是脂質(zhì)載體給藥系統(tǒng)中的重要技術(shù)之一，已成為基于寡核苷酸治療藥物的一個(gè)重要進(jìn)展。封裝在脂質(zhì)納米顆粒中的寡核苷酸在傳遞過(guò)程中受到保護(hù)，不受酶降解，并有效地傳遞到細(xì)胞中，在細(xì)胞中載體顆粒中的內(nèi)容物被釋放并被翻譯為治療蛋白。鑒于LNPs對(duì)基于寡核苷酸的治療具有巨大的革命性潛力，新一波研究人員正在追求基于LNPs更有針對(duì)性的應(yīng)用。

如何設(shè)計(jì)一個(gè)脂質(zhì)納米顆粒的藥物載體？
在選擇脂類及其如何配制成LNPs時(shí)，應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素。

1.脂質(zhì)摩爾比決定了顆粒的脂質(zhì)組成，并影響其大小、多分散性和功效。建議參考此前已開(kāi)發(fā)的類似應(yīng)用，從相關(guān)文獻(xiàn)入手，以確定脂質(zhì)摩爾比。下表展示了FDA批準(zhǔn)的LNPs藥物的脂質(zhì)摩爾比:

FDA批準(zhǔn)的LNPs藥物中的脂質(zhì)摩爾比（*Ionizable cationic lipid : neutral phospholipid : cholesterol : PEGylated lipid）
（相關(guān)產(chǎn)品鏈接請(qǐng)見(jiàn)文末）

2.脂質(zhì)與寡核苷酸的重量比影響包封效率。大多數(shù)LNPs的配方為脂質(zhì):寡核苷酸重量比為10:1。

3.可電離脂質(zhì)氮:寡核苷酸磷酸(N:P)摩爾比表示可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)陽(yáng)離子叔胺與寡核苷酸主鏈陰離子磷酸基團(tuán)之間的電荷平衡。這一性質(zhì)是電離陽(yáng)離子脂質(zhì)與寡核苷酸絡(luò)合的基礎(chǔ)。LNP的N:P比率通常在6左右。  

4.脂酸解離常數(shù)(脂質(zhì)pKa)是脂質(zhì)在相同濃度下的電離和非電離形態(tài)的pH值。脂質(zhì)pKa影響LNP的包封效率、療效、傳遞和毒性。 對(duì)于RNA傳遞，脂質(zhì)pKa一般在6-7之間。已經(jīng)確定了不同給藥途徑的具體范圍。靜脈給藥和肌肉給藥的最佳脂質(zhì)pKa范圍分別為6.2-6.6和6.6-6.9。  

5.水緩沖液的三個(gè)重要參數(shù)是它的組成、離子強(qiáng)度和pH值。緩沖液穩(wěn)定溶液中的寡核苷酸，可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)在酸性水緩沖液中混合后變成質(zhì)子化和正電荷。LNP制劑中常用的緩沖液為25-50 mM的醋酸鈉或檸檬酸鈉，pH為4-5。LNPs被透析到中性緩沖液中，如pH 7.4的PBS中儲(chǔ)存和使用。  

6.顆粒大小改變給藥顆粒的藥代動(dòng)力學(xué)。 更小的顆粒通常有更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期，因?yàn)樗鼈兲颖軉魏送淌杉?xì)胞機(jī)制的清除。小于100nm的顆?？奢p易通過(guò)有孔的內(nèi)皮細(xì)胞穿透靶組織。顆粒大小取決于制備方法。根據(jù)LNP制備方法的不同，可以使用擠壓來(lái)實(shí)現(xiàn)更小、更均勻的顆粒尺寸。  

7.兩種常用的給藥途徑是靜脈注射和肌肉注射。 靜脈給藥的LNP主要分布在肝臟和脾臟，但也分布在肺部。帶凈正電荷、中性電荷和負(fù)電荷的LNPs可分別靶向肺、肝和脾。在配方中加入膽固醇或聚乙二醇化脂質(zhì)，以及增加LNP的大小，增加了脾臟的分布。肌肉注射通常用于疫苗，因?yàn)樗兄诹馨徒Y(jié)靶向和激活免疫反應(yīng)。當(dāng)使用疫苗時(shí)，抗原提呈細(xì)胞(APCs)，如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，被招募到交付點(diǎn)，在那里它們可以遇到疫苗抗原。 然后它們轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，刺激T細(xì)胞反應(yīng)。值得注意的是，針對(duì)某一特定給藥途徑進(jìn)行優(yōu)化的制劑通常不適用于其他給藥途徑。

8.制備方法決定了LNPs的性質(zhì)，包括尺寸、均勻性和包封效率。 在選擇制備方法時(shí)，還應(yīng)考慮成本、可擴(kuò)展性、可再現(xiàn)性和時(shí)間承諾。

LNPs的制備步驟
本文給出了一系列用于生產(chǎn)LNP的大致流程，包括LNP生命周期的整個(gè)范圍，從LNP從實(shí)驗(yàn)臺(tái)上的準(zhǔn)備開(kāi)始，到如何使用LNP，以及在體外/體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用LNP時(shí)的預(yù)期結(jié)果。

1.LNP的準(zhǔn)備
在開(kāi)始之前，確保所有的供應(yīng)品、試劑和工作環(huán)境是RNase-free的。siRNA和mRNA在化學(xué)上對(duì)RNase不穩(wěn)定，RNase是降解RNA寡核苷酸的酶。圖1總結(jié)了LNP形成的步驟。

LNP制備工作流程

2.混合
LNPs的制備方法是將乙醇脂混合物與含有寡核苷酸的酸性水緩沖液混合(如下圖)。通常使用1:3的乙醇脂混合物與水緩沖液的比例。有幾種方法適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小體積LNP生產(chǎn)。

含寡核苷酸的LNP形成示意圖

下文和下表對(duì)其中的四種混合方法進(jìn)行了比較，這些方法適用于一系列從專業(yè)到基本的設(shè)備。

微流體混合設(shè)備：自動(dòng)化微流體混合設(shè)備或微流控芯片是快速高效制備LNPs的方法。這些器件能夠以高度可控、可重復(fù)的方式快速混合，從而獲得均勻的LNPs和高封裝效率。在這些裝置中，乙醇脂混合物和寡核苷酸水溶液的單獨(dú)流被迅速結(jié)合。脂質(zhì)納米顆粒形成時(shí)，兩股溶液混合，并收集到一個(gè)單獨(dú)的管中?？梢酝ㄟ^(guò)改變流量比和總流量等參數(shù)來(lái)微調(diào)LNPs。

T型或y型混合器：這些混合器可以用普通和實(shí)惠的實(shí)驗(yàn)室材料組裝。T型或y型接頭可安裝兩個(gè)入口，連接到裝有脂質(zhì)混合物或寡核苷酸溶液的單獨(dú)注射器，一個(gè)出口將LNPs引導(dǎo)到收集管中，進(jìn)口流量可以控制注射泵。

乙醇注射：此方法適用于所有實(shí)驗(yàn)室。乙醇脂混合物和寡核苷酸水溶液的混合是在磁攪拌板的幫助下進(jìn)行的。將乙醇脂混合物注入酸性寡核苷酸水溶液中，不斷攪拌，繼續(xù)攪拌30分鐘。但這種方法可能產(chǎn)生更多不均勻的LNPs，包封效率較低，容易發(fā)生變化。

手工混合：這是乙醇注射的一種更簡(jiǎn)單的替代方法。 將乙醇脂混合物轉(zhuǎn)移到酸性寡核苷酸水溶液中，通過(guò)快速移液混合15秒。 將混合物靜置10分鐘。 與乙醇注射法一樣，手工混合LNPs得到的是包封效率較低的非均質(zhì)LNPs，且結(jié)果多變。

幾種LNP制備方法的特點(diǎn)比較

3.最終制備步驟
LNPs的最終制備是在混合步驟中形成后進(jìn)行的。 以下步驟可確保這些廢物在貯存和使用期間均質(zhì)、穩(wěn)定，并無(wú)任何殘留的化學(xué)或生物污染物。

擠壓：擠壓減小了顆粒尺寸，并產(chǎn)生均勻的顆粒尺寸分布。 這一步通常用大量混合方法進(jìn)行，如乙醇注射和手工混合方法。  

透析：使用適當(dāng)?shù)姆肿恿拷財(cái)?MWCO)管在儲(chǔ)存緩沖液中透析LNPs。 這一步除去未封裝的貨物，多余的脂質(zhì)成分和乙醇從最后的準(zhǔn)備。 透析還可以調(diào)節(jié)LNPs從酸性制備緩沖液到中性儲(chǔ)存液的pH值。  

過(guò)濾消毒：過(guò)濾是LNPs滅菌的推薦方法。過(guò)濾-儲(chǔ)存前用0.22μm濾網(wǎng)消毒LNPs，以去除細(xì)菌或其他污染物。 對(duì)于較大顆?；蚋唣ば匀芤海刹捎闷渌麥缇椒?，如高壓滅菌或輻照，盡管這些方法可能會(huì)影響嶺土核電站的結(jié)構(gòu)完整性。

LNPs的穩(wěn)定性和儲(chǔ)存
LNPs準(zhǔn)備好后，可立即使用或儲(chǔ)存以備以后使用。下面呈現(xiàn)了存儲(chǔ)過(guò)程中可能影響LNP解決方案完整性的因素，并提供如何限制存儲(chǔ)不穩(wěn)定性的提示。

1.物理穩(wěn)定性是指LNPs在貯存期間的結(jié)構(gòu)完整性。 粒子融合或聚集，以及封裝貨物的泄漏是物理不穩(wěn)定的例子。

確保大小分布保持小而均勻:  
· 在LNP配方中使用陰離子或聚乙二醇化脂質(zhì)來(lái)防止顆粒融合/聚集  

防止貨物滲漏:  
· 在LNP配方中加入膽固醇  

存儲(chǔ)要求:  
· 調(diào)節(jié)存儲(chǔ)溫度，緩沖液和pH值  
· 避免凍融循環(huán)

2.化學(xué)穩(wěn)定性決定了LNP脂質(zhì)和貨物組分在分子結(jié)構(gòu)上的抵抗性。 水解、氧化和酯交換可導(dǎo)致寡核苷酸和脂質(zhì)降解或形成脂質(zhì)-寡核苷酸加合物并失去功效。  

控制內(nèi)容藥物的分解:  
· 使用不含RNase的試劑和用品  
· 考慮具有抗降解的糖-磷酸鹽主干修飾的寡核苷酸貨物  

防止脂質(zhì)氧化:  
· 在儲(chǔ)存過(guò)程中加入抗氧化劑，如α-tocopherol，或者冷凍保護(hù)劑，如海藻糖或蔗糖  

存儲(chǔ)要求:  
· 調(diào)節(jié)存儲(chǔ)溫度，緩沖液和pH值  
· 避免凍融循環(huán)

3.生物穩(wěn)定性與LNPs避免在體外或體內(nèi)系統(tǒng)中早期降解的能力有關(guān)。 影響生物穩(wěn)定性的因素包括脂質(zhì)組成、顆粒大小和表面電荷。  

減少血清蛋白調(diào)理:  
· 包括聚乙二醇脂質(zhì)  
· 減少顆粒大小  
· 達(dá)到接近中性的zeta電位  
· 增加LNP親水性  

減少早期漏貨:  
· 按照存儲(chǔ)需求  
· 使用可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)  
· 包含長(zhǎng)脂和/或不飽和脂  
· 在LNP配方中加入膽固醇  

4.貯存是影響LNP制劑穩(wěn)定性的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。  
一般說(shuō)來(lái)，LNPs可在4°C下保存長(zhǎng)達(dá)1周，或在-80°C下冷凍干燥保存。存儲(chǔ)溫度、緩沖液和pH值可能需要優(yōu)化。建議在冷凍時(shí)加入凍干或不加凍干的低溫保護(hù)劑。

LNP的特性
在體外或體內(nèi)使用前對(duì)LNP的表征對(duì)于實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性至關(guān)重要。適用于LNP表征的分析方法見(jiàn)下表：

 
（*Adapted from Schoenmaker, L., et al. 2021 and Lin et al. 2014）

1.LNP的大?。↙NP size）描述了LNP的平均直徑。 LNP的大小影響生物分布和細(xì)胞攝取，從而影響LNP的有效性。多分散性指數(shù)(PDI)是衡量LNP粒徑分布的一個(gè)指標(biāo)。均勻、大小均勻的樣本具有較小的PDIs，而大小分布不均的樣本具有較大的PDIs。通過(guò)優(yōu)化脂質(zhì)成分、增加混合速率、選擇不同的制備方法或添加擠出步驟，可以降低LNP制劑的LNP大小和PDI。  

2.Zeta電位（Zeta potential）是LNP周圍的靜電電位。一般來(lái)說(shuō)，接近中性的zeta電位是可取的。陰離子型LNPs可能被帶負(fù)電荷的質(zhì)膜靜電排斥，而陽(yáng)離子型LNPs可能具有細(xì)胞毒性。 zeta電位可以通過(guò)改變N:P來(lái)調(diào)節(jié)。

3.封裝效率（Encapsulation efficiency）是LNP中所含寡核苷酸的量與混合過(guò)程中所使用的起始量的比較。 微流體混合方法產(chǎn)生高的封裝效率。  

4.顆粒濃度（Particle concentration）的定量是必要的，以確保實(shí)驗(yàn)之間的比較結(jié)果。 另外，也可以確定脂質(zhì)和RNA組分的最終濃度。 LNPs可通過(guò)超離心濃縮或按需要稀釋。  

5.脂質(zhì)和內(nèi)容藥物的完整性（Lipid and cargo integrity）對(duì)LNPs的有效性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。 有關(guān)更多信息，請(qǐng)參閱下面的存儲(chǔ)和穩(wěn)定性部分。

驗(yàn)證
LNPs通過(guò)內(nèi)吞作用被靶細(xì)胞內(nèi)吞。內(nèi)含體逃逸是在內(nèi)吞作用后LNP的內(nèi)容物被運(yùn)送到胞漿的過(guò)程。 可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)在內(nèi)體腔內(nèi)的酸性環(huán)境中質(zhì)子化并帶正電荷，這破壞了帶負(fù)電荷的內(nèi)體膜，促進(jìn)被包裹的寡核苷酸被釋放到胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中翻譯。  

可以通過(guò)簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)確認(rèn)LNPs的體外療效。可分別通過(guò)qPCR或Western blot檢測(cè)感興趣的基因或蛋白的敲低或表達(dá)?；诩?xì)胞的報(bào)告基因測(cè)定也被用于確定LNP的有效性。  

寡核苷酸產(chǎn)物在體內(nèi)的蛋白表達(dá)遵循一個(gè)目標(biāo)依賴的時(shí)間過(guò)程。 編碼功能性蛋白質(zhì)的封裝寡核苷酸在數(shù)小時(shí)內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度的變化，而那些編碼的貨物可以在幾天到幾周內(nèi)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。 由于寡核苷酸容易降解，因此經(jīng)常需要使用反復(fù)給藥方案來(lái)實(shí)現(xiàn)持續(xù)的蛋白表達(dá)。ELISA和多重分析可用于測(cè)量靶蛋白和抗體反應(yīng)，以及細(xì)胞因子和趨化因子濃度，這為了解LNP的免疫原性和耐受性提供了深入的認(rèn)識(shí)。  

給藥后LNP的命運(yùn)取決于脂質(zhì)組成、LNP設(shè)計(jì)和給藥途徑。經(jīng)靜脈給藥后，LNPs通常分布到肝臟和脾臟。 肌內(nèi)給藥的目的是針對(duì)淋巴結(jié)，但經(jīng)常誘導(dǎo)局部和遠(yuǎn)端(如肝臟)蛋白表達(dá)。 因此，用于LNP的脂質(zhì)在這些組織中也可檢測(cè)到。LNPs中使用的脂類具有生物相容性，可迅速降解，一般在給藥后24至48小時(shí)內(nèi)消除。為了確定脂質(zhì)組織濃度，可以使用基于質(zhì)譜的方法。

文章部分相關(guān)產(chǎn)品：
化合物

LNP探索工具盒

測(cè)量LNP誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的試劑盒