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染色質(zhì)生化研究進入條碼測序時代

點擊次數(shù)：903 發(fā)布時間：2014-9-10

帶“條形碼”的半合成核小體（nucleosome）搭配大規(guī)模平行測序技術(shù)（massively parallel sequencing），能夠為人類提供一個全新的技術(shù)平臺，用來分析染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)（chromatin-associated proteins）的組蛋白識別（histone-recognition）及組蛋白修飾（histone-modifying）活性。

科學(xué)家過去一直認(rèn)為組蛋白的功能非常簡單，只是在DNA的核內(nèi)包裝過程中起到一個架的作用。但是現(xiàn)在他們已經(jīng)逐漸認(rèn)識到了組蛋白，以及組蛋白的各種翻譯后修飾作用（post-translational modifications， PTM）在DNA可接近性（DNA accessibility），以及基因組功能方面所具備的重要的動態(tài)調(diào)控功能。

在眾多作用機制當(dāng)中，組蛋白的PTM可以通過招募各種效應(yīng)蛋白（effector protein）來發(fā)揮調(diào)控作用，這些效應(yīng)蛋白能夠解析在染色質(zhì)上的各種組蛋白PTM狀態(tài)。

經(jīng)過近20年的科學(xué)研究，科學(xué)家對這些PTM是如何產(chǎn)生、刪除，以及如何被解讀的機制的認(rèn)識有了比較大的提升，但我們還是不太清楚這些PTM在核小體這種染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單元中發(fā)揮的生化作用是如何被調(diào)控的。

不過z近在這方面取得了突破，Nguyen等人將天然化學(xué)連接重組核小體技術(shù)（native chemical ligation coupled with recombinant nucleosome technology）與高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing）這兩種在染色質(zhì)生化研究工作中比較成熟的技術(shù)結(jié)合起來，開發(fā)出了一種功能強大，適用范圍有非常廣的新方法，利用各種打好條形碼的核小體文庫，就可以確定這些功能復(fù)雜的染色質(zhì)條款因子了。

在發(fā)現(xiàn)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases）具備轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能之后，科學(xué)家們又緊接著利用各種經(jīng)過修飾的組蛋白多肽（modified histone peptides）開展了一系列對今后具有重大影響作用的結(jié)構(gòu)研究和生化研究，發(fā)現(xiàn)bromodomain結(jié)構(gòu)域就是一種能夠識別乙酰基—賴氨酸（acetyl-lysine）結(jié)構(gòu)的基序，在這個確鑿證據(jù)的支持下，從而將組蛋白PTM與基因活性給了起來。

后來由于利用了固定組蛋白多肽（immobilized histone peptides）或各種已標(biāo)記識別結(jié)構(gòu)域（tagged putative reader domains）的高通量芯片篩查技術(shù)（high-throughput， microarray-based screening）有了進一步的發(fā)展，我們在發(fā)現(xiàn)PTM識別結(jié)構(gòu)，以及PTM靶標(biāo)結(jié)構(gòu)等方面又取得了不錯的成果，發(fā)現(xiàn)了好些染色之效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，比如惡性腦腫瘤結(jié)構(gòu)域（malignant brain tumor domain）、Tudor結(jié)構(gòu)域和植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain）等。

雖然已經(jīng)取得了這些不錯的成績，了解了一些效應(yīng)蛋白與染色質(zhì)的相互作用機制，但這主要反映的都是一個結(jié)構(gòu)域與幾種修飾后的組蛋白多肽之間的相互作用?？墒呛芏嘈?yīng)蛋白里都含有好幾個識別結(jié)構(gòu)域，每一個核小體也都含有兩對核心組蛋白（即H2A、H2B、H3及H4組蛋白），有些核小體里還含有H2A.Z、H2A.X和H3.3等其他組蛋白，這些組蛋白在染色質(zhì)里都有各自*的作用，我們對此還是知之甚少。核小體和效應(yīng)蛋白的這種組織結(jié)構(gòu)創(chuàng)造出了非常復(fù)雜的染色質(zhì)識別體系。

比如，一個含有多個結(jié)合結(jié)構(gòu)域的染色質(zhì)效應(yīng)蛋白就應(yīng)該能夠異性地識別一個組蛋白上的多個不同的PTM，或者位于一個核小體、或者相鄰核小體上的多個不同組蛋白上的PTM。實際上，z近開展的一項研究使用半合成核小體也證實了，NURF染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體中的BPTF亞基就能夠依靠其自身的bromodomain結(jié)構(gòu)域和植物同源結(jié)構(gòu)域，通過反式相互作用（trans interactions）分別識別H4K16ac和H3K4me3這兩種組蛋白PTM。這種依靠核小體的實驗技術(shù)也讓我們能夠在更加符合生理狀態(tài)的條件下，研究染色質(zhì)效應(yīng)蛋白與各種PTM之間的關(guān)系，但低通量是這種方法的缺陷，一次只能研究一個核小體因子。所以嚴(yán)重阻礙了染色質(zhì)核小體研究工作的進展。

圖1 帶有各種已修飾組蛋白的DNL可以被用來驗證組蛋白PTM抗體的異性，研究帶有單個或多個識別結(jié)構(gòu)域的核小體間的相互作用，以及驗證酶的組蛋白修飾活性。其基本作用原理都是對各種實驗富集的核小體上的DNA條形碼進行大規(guī)模平行測序。

Nguyen等人采用的則是一種現(xiàn)有技術(shù)的改進版，他們利用表達蛋白連接技術(shù)（expressed-protein ligation technology）快速地生成了規(guī)模龐大的半合成核小體文庫，這些半合成核小體的一個或者多個組蛋白上全都帶有一個或者多個非常明確的、已知的PTM。他們的創(chuàng)新之處就在于使用了帶有*條形碼標(biāo)簽的DNA來合成人工核小體。

由這些核小體組成的DNA標(biāo)記核小體文庫（DNA-barcoded nucleosome libraries， DNL）會被用于具有與染色質(zhì)免疫沉淀（in vitro chromatin immunoprecipitation）體外實驗同樣靈敏度的競爭性生化反應(yīng)（competitive in-solution biochemical assay），然后對實驗所得再進行高通量測序，即用于所謂的ChIP-seq實驗（圖1）。除了高通量確定組蛋白識別結(jié)構(gòu)域和修飾因子的PTM異性這一個作用之外，DNL文庫技術(shù)還能夠?qū)TM異性抗體進行驗證。實際上，抗體的異性是染色質(zhì)研究領(lǐng)域非常關(guān)注的一個問題，尤其在要求高性全基因組組蛋白PTM分析這個工作方面更是如此。

Nguyen等人使用這個技術(shù)平臺對BPTF和BRD4這兩種已經(jīng)被研究得非常清楚的組蛋白識別結(jié)構(gòu)域，以及p300這種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶進行了驗證性實驗。除了發(fā)現(xiàn)了這些因子之間的已知的相互作用之外，他們還發(fā)現(xiàn)組蛋白H4的多聚乙酰化作用（polyacetylation）在招募這些因子時也起到了非常重要的作用。尤其值得一提的是，p300與多聚乙?；腍4蛋白之間的結(jié)合進一步促進了p300對組蛋白的乙酰化修飾作用，即起到了一個正反饋的作用。Nguyen等人還發(fā)現(xiàn)，在H3K4me3核小體中也存在這樣一個正反饋通路，這也就更進一步明確了反式組蛋白相互作用對p300這樣的染色質(zhì)調(diào)控因子也產(chǎn)生了影響。

在染色質(zhì)研究工作中，建立DNL文庫是一項重大的進步，很有可能會在不久的未來帶來突破性的進展。雖然Nguyen等人的工作已經(jīng)非常清楚地證實了該技術(shù)的強大優(yōu)勢，但是半合成核小體構(gòu)建工作還是存在一些技術(shù)上的難點，需要對有機化學(xué)實驗技術(shù)和生物化學(xué)實驗技術(shù)相當(dāng)熟練的人才能夠勝任。所以這項技術(shù)是否能夠得到廣泛推廣，我們還需要拭目以待。

除此之外，這種半定量式的方法可能也不太適合解析復(fù)雜的相互作用，比如PTM不對稱識別（比如同一個核小體內(nèi)的H3二聚體分別進行了不同的PTM修飾）或者攜帶有不同PTM的兩個相鄰核小體間的反式相互作用（trans inter-nucleosomal interactions）等。不過隨著DNL技術(shù)的不斷推廣和應(yīng)用，這些問題在未來肯定會得到妥善的解決。無論如何，這種新技術(shù)在解析復(fù)雜的染色質(zhì)調(diào)控因子招募和作用這個領(lǐng)域一定會做出更大的成績。

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