Collagenase V膠原酶V型

Collagenase V膠原酶V型（細(xì)胞分離與流式）

產(chǎn)品描述

膠原酶（Collagenase）是一種蛋白酶，一種肽鏈內(nèi)切酶，能夠特異性的識別Pro-X-Gly-Pro序列（該序列高頻率出現(xiàn)在膠原中，很少發(fā)現(xiàn)于其他蛋白中）并切割該序列中性氨基酸（X）和甘氨酸（Gly）之間的肽鍵。許多蛋白酶都能水解單鏈且變性的膠原多肽，但只有膠原酶是可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶，這種膠原纖維廣泛存在結(jié)締組織內(nèi)。

本品來源于溶組織梭菌（Clostridium histolyticum），是一種酶粗提物，不僅含有膠原酶（更準(zhǔn)確的稱法為梭菌蛋白酶A（clostridiopeptidase A）），能夠降解天然膠原和網(wǎng)狀纖維。還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等，分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白，多糖和脂質(zhì)，使得本品非常適用于組織消化。

目前商業(yè)化提供的細(xì)菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異，分為四種類型：膠原酶I型、II型、III型和IV型，在應(yīng)用上有所偏向：

幾種膠原酶特征和應(yīng)用比較:

Collagenase V膠原酶V型（細(xì)胞分離與流式）

本品為V型膠原酶，≥125 CDU/mg solid（CDU = collagen digestion units），部分純化型,含更高的膠原酶和酪蛋白活性,更低胰酶水平以降低對膜蛋白和受體造成損傷。
適用于胰島制備。

產(chǎn)品屬性

CAS NO：9001-12-1

EC NO：EC 3.4.24.3

分子量（Molecular Weight）：68-130 kDa

酶活力單位定義:在37℃，pH7.5 的條件下，5h內(nèi)水解膠原產(chǎn)生相當(dāng)于1µM L-亮氨酸的酶量定義為1個酶活力單位。

運輸和保存方法

室溫運輸。4℃避光保存，2年有效。儲存液-20℃避光凍存。

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

Collagenase V膠原酶V型（細(xì)胞分離與流式）

使用方法

膠原酶儲存液的配制

 向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS（Hank’s平衡鹽溶液，含Ca2+、Mg2+），輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1g/ml（即1000×）的儲存液。然后用低蛋白結(jié)合性的0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝成小份量，然后于-20℃避光凍存。

使用前于冰上解凍，避免反復(fù)凍融。其用于組織和細(xì)胞分散的常用濃度為：0.5-2.5mg/ml，用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml，需要根據(jù)特定的實驗條件或者參考相應(yīng)的文獻(xiàn)資料確定所需的適合工作濃度。

組織的分離

1）使用無菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊；

2）利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次；

3）加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS，使其浸沒組織塊，并加入膠原酶至需要工作濃度；

4）于37℃孵育4-18h。消化時使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補充消化可以提高消化效率。

5） 已分散開的細(xì)胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得，收集備用。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育；

6）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次；

7）細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞，利用自動細(xì)胞計數(shù)器或其他方法計算活細(xì)胞密度。

8）于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。

 器官灌注

1）向37℃預(yù)熱的含Ca2+、Mg2+的HBSS中加入膠原酶，另添加3mM的CaCl2有助于提高分離效率；

2）按照已優(yōu)化的速率對相應(yīng)的器官灌注膠原酶工作液；

3）將上述過程中回收的灌注液流經(jīng)不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩，從而將已解離的細(xì)胞或小片段組織塊與較大團(tuán)塊分離開來，未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進(jìn)一步孵育；

4）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次；

5）細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞，利用自動細(xì)胞計數(shù)器或其他方法計算活細(xì)胞密度。

6）于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。