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如何構建多順反子表達載體？
隨著各種基因組測序項目的完成，越來越多的基因被發(fā)現，但多數基因功能不明，故研究基因的功能十分重要。分子克隆是基因功能研究中zui為基礎和關鍵的內容。利用分子克隆技術將外源基因插入質粒載體，進行外源基因的表達可能不是一件難事。但要同時表達多個基因時，傳統(tǒng)的方法可能就比較困難。下面給大家介紹一種多個外源基因表達的方法—構建多順反子表達載體。
以EGFRvIII基因、P2A多順反子元件、iRFP720基因插入到pLVX-TetOne載體中為例，介紹如何利用傳統(tǒng)酶切酶連技術和同源重組技術進行構建多順反子表達載體。 
酶切酶連技術
使用傳統(tǒng)酶切酶連法進行克隆時，首先需要分析酶切位點，經分析發(fā)現只有AgeI和BstZ17I兩個酶切位點可用于EGFRvIII基因克隆，因為另外兩個酶切位點BamHI和EcoRI同時存在于EGFRvIII基因的內部，導致無法使用。而P2A元件和iRFP720基因必須和EGFRvIII基因處于同一個讀碼框，又導致無法使用AgeI酶切位點進行后續(xù)的克隆。針對這種酶切位點無法選擇的情況，我們可以選擇不需要考慮酶切位點的同源重組技術。
同源重組技術
使用同源重組技術無需考慮載體的酶切位點，只需在目的片段特異性上、下游引物5’端引入與線性化載體末端同源序列（15-25bp）即可。
1、制備線性化載體：可以用PCR或酶切的方式得到線性化的pLVX-TetOne載體。（膠回收純化）
2、目的基因的引物設計：EGFRvIII上游引物、 RFP720下游引物分別與線性化的pLVX-TetOne載體具有15-25bp的同源序列，并且EGFRvIII，P2A及iRFP720片段彼此之間也有15-25bp的同源序列。（這里要提到的是，P2A元件很短，僅有66 bp，有可能被重組酶中的外切酶*降解。我們可以通過兩輪PCR，在擴增iRFP720基因的上游引物的5’端引入部分P2A序列，即可獲得P2A + iRFP重組片段。對于這種目的基因過短的情況，可以采取這種方式。）
3、目的基因的擴增：EGFRvIII，P2A及iRFP720三個基因的擴增。（膠回收純化）
4、重組反應：將EGFRvIII，P2A及iRFP720三個基因同時插入到pLVX-TetOne載體中。
5、轉化：將重組反應物轉化到克隆感受態(tài)細胞中。
6、克隆鑒定：通過菌落PCR，雙酶切或測序鑒定陽性克隆。
7、表達：轉到表達感受態(tài)中進行表達。實現Tet-on誘導表達EGFRvIII基因，同時還能表達iRFP720基因，用于小動物活體熒光成像。
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