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HB170102
【技術(shù)帖】NGS文庫質(zhì)檢方法與注意事項
——文庫大小、質(zhì)量、污染物評測
文庫的質(zhì)量對于高通量測序（NGS）產(chǎn)出的數(shù)據(jù)質(zhì)量至關(guān)重要。過低估計文庫的質(zhì)量，導致Clusters或多重模板太多，數(shù)據(jù)質(zhì)量不高；過高估計文庫的質(zhì)量，導致數(shù)據(jù)讀取量少，基因組覆蓋率低，所以低估或者高估文庫質(zhì)量都會影響測序效果。
那么，如何判斷你做出來的文庫是可以用于上機測序的，而不是白費力氣建了個沒用的文庫？或者更糟糕，構(gòu)建出的文庫可以上機測序，但是得到了一堆沒有用的數(shù)據(jù)？
不要擔心，如果你的實驗設(shè)計精良，你只需要做3步簡單的質(zhì)控就可以判斷文庫是否合格。
Bioanalyzer——文庫長度檢測
qPCR/Qubit——文庫定量
Nanodrop——文庫污染物檢測
1. 文庫長度檢測
文庫長度檢測是文庫質(zhì)控的關(guān)鍵步驟。測序上機時，要求文庫等摩爾上樣（否則可能造成不同文庫簇生成密度不同，而影響測序質(zhì)量），文庫的平均長度是計算文庫摩爾數(shù)的要素之一。
文庫摩爾數(shù)（pmol）≈ 文庫質(zhì)量(ng)/ [0.66×文庫平均長度（bp）]
Agilent Bioanalyzer是進行文庫長度檢測zui常用的儀器，它基于微控流技術(shù)對樣本進行分離檢測。根據(jù)加樣要求，在DNA芯片中加入Ladder、Marker、Gel、Dye以及Sample，當給芯片加入電壓時，樣品便在芯片上的顯微蝕刻管道中進行毛細管電泳，在樣本流動過程中，不同DNA根據(jù)其大小被分離。同時凝膠-染料基質(zhì)中的熒光染料可嵌入DNA雙鏈，通過激光激發(fā)熒光，使其被儀器檢測到，儀器依據(jù)收集到的熒光信號強度對樣本粗略定量。
一般情況下，好的文庫應(yīng)該呈現(xiàn)出單一的、圓滑的峰，且接近正態(tài)分布，長度范圍在150-700bp之間。如下圖為使用100 ng E.coli gDNA建庫，接頭連接后進行雙輪分選（0.6×/0.2×和0.55×/0.15×）的檢測結(jié)果。
有時，文庫也可能在150-700bp的范圍之外出現(xiàn)雜峰。不同的雜峰大小與峰形可參照以下情況進行分析和實驗改進。
1) 在150bp以下出現(xiàn)雜峰
這種情況可認為是文庫擴增時的引物二聚體殘留或接頭殘留導致的，可以通過稍微降低磁珠使用比例重新純化文庫解決。注意，磁珠使用過程中的移液操作，切勿擾動磁珠。
2）在700bp以上出現(xiàn)雜峰
這種情況可認為是文庫擴增循環(huán)數(shù)過高，出現(xiàn)文庫過度擴增自我交聯(lián)導致的，可以通過文庫重新分選解決。
3）整個文庫呈現(xiàn)大小不對稱
這種情況可認為文庫分選操作不良或Input DNA的片段化不*導致的，可以通過重新進行文庫分選或者重新構(gòu)建文庫解決。
2. 文庫濃度檢測
文庫質(zhì)量也是計算文庫上機摩爾數(shù)的要素。常規(guī)使用qPCR法和熒光計法（以Qubit®常用）。
1）qPCR法
qPCR法使用特異性引物僅定量樣品中兩端接頭連接完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，是目前業(yè)內(nèi)進行文庫定量的金標準。使用qPCR法時，需要以不同濃度的已知長度DNA的片段（常為452bp）作為標準品進行標曲制作，進而進行文庫定量。
由于標準品與文庫的實際長度可能不同，因此計算時，需要對文庫質(zhì)量進行校正。
原始文庫濃度（nM）= [452 bp /文庫平均長度（bp）] × 稀釋文庫的濃度（pM）× 稀釋倍數(shù)/1000
一般情況下，理想的文庫濃度應(yīng)在10-100nM之間。如果文庫測定結(jié)果在100nM以上，表明文庫的PCR循環(huán)數(shù)過高，這可能會增加測序數(shù)據(jù)中的Duplicate rate，此時可以通過減低1個PCR循環(huán)數(shù)來獲得10-100nM之間的文庫。
為了獲得的定量結(jié)果，在使用qPCR方式進行文庫定量時，建議遵循以下原則：
Ø 等量分裝qPCR Mix和DNA標準品，避免模板污染和反復凍融的影響
Ø 在進行qPCR之前，將反應(yīng)體系配制區(qū)和模板制備區(qū)進行物理隔離，并定時使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑對各實驗區(qū)域進行擦拭清理。
Ø 待測樣本做梯度稀釋，并且同時做3個平行重復
Ø 檢查梯度稀釋液以及平行樣本具有一致性的可重復的測定值
Ø 檢查確定待測文庫Ct在標準曲線以內(nèi)時，使用標準曲線計算文庫濃度
2）熒光計法（Qubit®, Picogreen）
Qubit®是核酸和蛋白定量熒光儀，采用熒光染料檢測特定目標分子的濃度，能夠?qū)?/span>DNA和RNA進行定量。Picogreen是一種極為靈敏的熒光核酸染料，其僅在與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出熒光，且所產(chǎn)生的熒光與DNA濃度呈正比，是定量DNA文庫的zui常用染料。
由于染料與DNA雙鏈結(jié)合，但無法有效區(qū)分文庫雙鏈和其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)（如單端連接接頭產(chǎn)物或未連接接頭產(chǎn)物），所以相對qPCR法定量文庫來說，Qubit®方法的度稍弱一些，但是Qubit®出眾的簡便性、靈敏度以及低成本使得Qubit®成為測序?qū)嶒炇?的儀器之一。此外，Input DNA由于沒有添加接頭，是無法使用qPCR方式定量的，此時Qubit®方法相對其他如Nanodrop等方法來說，是zui為的方法。
使用Qubit®熒光計方法得到的文庫濃度以ng/μL為單位，而測序上機文庫以nM（nmol/L）為單位，因此測定值需要根據(jù)以下公式進行換算：
文庫摩爾數(shù)（nM）≈ 文庫質(zhì)量(ng/μL)×106/[660×文庫平均長度（bp）]
3. 文庫污染物檢測
Nanodrop是檢測樣本污染物zui快的方法之一，能夠在包括紫外及可見光區(qū)域在內(nèi)的光譜范圍內(nèi)檢測污染物的吸光度信號，核酸污染物的常用參考標準是A260/280和A260/230。
理想文庫的標準是A260/280>1.8，A260/230>2.0，不在該范圍時，建議重新進行文庫純化或者重新建庫，否則，可能造成文庫簇生成量少，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量差。
需要注意，不要使用Nanodrop做建庫過程中的DNA或RNA定量！
4. 相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
Hieff NGSTM MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina | 12200ES08 | 8 libraries | 2456.00 |
12200ES24 | 24 libraries | 6486.00 | |
12200ES96 | 96 libraries | 23567.00 | |
Hieff NGSTM DNA selection Beads（Superior AMPure XP alternative） | 12601ES03 | 1 mL | 296.00 |
12601ES08 | 5 mL | 986.00 | |
12601ES56 | 60 mL | 6286.00 | |
12601ES75 | 450 mL | 26186.00 | |
dsDNA HS Assay Kit for Qubit® | 12640ES60 | 100 T | 686.00 |
12640ES76 | 500 T | 2696.00 | |
Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina, qPCR Master Mix | 12302ES05 | 500 T | 1526.00 |
Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina, DNA Standard (1-6) | 12307ES09 | 6×96 μL | 2126.00 |
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