實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR，簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR）是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的高靈敏度、高特異性的分子生物學(xué)技術(shù)，用于定量分析DNA或RNA的含量。它通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的熒光信號(hào)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)核酸的定量分析。
原理定義：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的原理基于PCR反應(yīng)的擴(kuò)增過(guò)程，在此過(guò)程中利用熒光染料或熒光探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量。
PCR擴(kuò)增過(guò)程：
通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，DNA模板經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)逐步擴(kuò)增，生成大量的目標(biāo)DNA片段。
在每一個(gè)循環(huán)中，模板DNA會(huì)被熱變性（使雙鏈DNA分開(kāi)）、退火（引物與模板配對(duì)）和延伸（DNA聚合酶合成新鏈）等步驟逐漸擴(kuò)增。
熒光信號(hào)的產(chǎn)生：
在擴(kuò)增過(guò)程中，熒光染料或探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)。實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)通過(guò)監(jiān)測(cè)這些熒光信號(hào)的變化來(lái)判斷目標(biāo)核酸的數(shù)量。
常用的熒光探針和染料包括：
SYBRGreen：與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光，適用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
TaqMan探針：是一種帶有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的探針，只有當(dāng)探針與目標(biāo)DNA結(jié)合并在PCR反應(yīng)過(guò)程中被DNA聚合酶切割時(shí)，才會(huì)釋放熒光信號(hào)。
MeltCurve分析：通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析，可以進(jìn)一步確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。
實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量：
在每一輪PCR擴(kuò)增的過(guò)程中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)都會(huì)在每一個(gè)擴(kuò)增周期結(jié)束時(shí)，檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此可以通過(guò)熒光信號(hào)的變化曲線(xiàn)來(lái)推算目標(biāo)核酸的初始濃度。
在PCR反應(yīng)的指數(shù)擴(kuò)增階段，熒光信號(hào)與目標(biāo)DNA的量呈指數(shù)關(guān)系，系統(tǒng)可以通過(guò)分析信號(hào)的上升曲線(xiàn)（Ct值，臨界閾值）來(lái)定量目標(biāo)DNA或RNA的濃度。
定量分析：
Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）：是指PCR反應(yīng)中，熒光信號(hào)達(dá)到預(yù)設(shè)的閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。Ct值與樣本中的初始靶標(biāo)DNA/RNA濃度成反比，Ct值越小，表示初始模板的濃度越高。
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣本的Ct值對(duì)其進(jìn)行定量。
相對(duì)定量：可以通過(guò)對(duì)照基因或內(nèi)參基因的表達(dá)量與目標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行比對(duì)，得出目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。
優(yōu)點(diǎn)：
高靈敏度與高特異性：通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，可以在PCR擴(kuò)增的初期階段檢測(cè)到目標(biāo)核酸，具有很高的靈敏度和特異性。
定量精準(zhǔn)：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每一個(gè)PCR循環(huán)中的熒光信號(hào)，可以精確地定量目標(biāo)核酸的初始含量。
無(wú)需后期電泳：與傳統(tǒng)的PCR方法不同，實(shí)時(shí)熒光定量PCR不需要使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，減少了操作時(shí)間和誤差。
應(yīng)用：
基因表達(dá)分析：用于檢測(cè)基因的相對(duì)或絕對(duì)表達(dá)量。
病原檢測(cè)：如病毒、細(xì)菌等的定量檢測(cè)。
基因突變分析：檢測(cè)特定基因的突變。
定量檢測(cè)DNA、RNA：適用于定量DNA或RNA模板，包括mRNA、miRNA、DNA甲基化等。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR為分子生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了強(qiáng)大的工具，尤其是在基因表達(dá)、疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。
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