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細(xì)菌糖類總量硫酸-苯酚比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

細(xì)菌糖類總量硫酸-苯酚比色法定量檢測試劑是一種旨在通過硫酸處理后，水解產(chǎn)生單糖，與苯酚反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物，即采用比色法測算糖類總量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)菌細(xì)胞樣品中糖類總量的檢測。產(chǎn)品即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

 

技術(shù)背景

 

糖類（saccharide），又稱為碳水化合物（carbohydrate），其分成四類：單糖（monosaccharide；例如葡萄糖）、二糖（disaccharide；例如蔗糖）、寡糖（oligosaccharide；棉籽糖）和多糖（polysaccharide；例如淀粉和糖原）。糖類構(gòu)成輔酶和核酸，以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要元素，在能量儲存、免疫功能、授精、預(yù)防病理變化、血液凝結(jié)、發(fā)育等方面具有重要作用。使用濃硫酸，將復(fù)雜性多糖水解成單糖，脫水產(chǎn)生反應(yīng)性中間產(chǎn)物，與苯酚反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物，在分光光度儀（492nm 波長）下出現(xiàn)吸光峰值的變化，來定量測定樣品中糖類量的總含量。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

稀釋液（Reagent A）                    5毫升

反應(yīng)液（Reagent B）                    5毫升

酸性液（Reagent C）                   25毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）                  500微升

裂解液（Reagent E）                   10毫升

產(chǎn)品說明書               1份

 

保存方式

 

保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和反應(yīng)的容器

干式恒溫儀或恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

超聲儀：用于裂解細(xì)菌細(xì)胞

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

 

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、 樣品準(zhǔn)備

 

1． 準(zhǔn)備好10毫升待測的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM

2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入500微升裂解液（Reagent E），充分混勻

7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

8． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

9． 置于超聲儀下：200瓦，50%功率，10秒一次，重復(fù)3次

10． 冰槽里靜置15分鐘

11． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

12． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

13． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

14． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

 

1． 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管

2． 分別加入200微升稀釋液（Reagent A）到每個離心管

3． 移取200微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到1號管，混勻

4． 小心移取200微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到2號管，混勻

5． 小心移取200微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到3號管，混勻

6． 小心移取200微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到4號管，混勻

7． 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

 

 

三、 樣品測定

 

1． 設(shè)定好分光光度儀：波長492nm，并置零

2． 分別移取200微升反應(yīng)液（Reagent B）到1.5毫升離心管

3． 分別加入200微升上述制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測樣品，混勻

4． 分別加入1毫升酸性液（Reagent C），混勻

5． 在80℃干式恒溫儀孵育30分鐘（注意：如果復(fù)雜多糖無法充分水解，建議使用煮沸5至30分鐘處理）

6． 室溫下冷卻10分鐘，避免光照

7． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測（492nm波長）：獲得吸光讀數(shù)

9． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖含量（微克）

10． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)麥芽糖含量（微克）

11． 計算樣品實(shí)際麥芽糖濃度（微克/毫升） 

 

【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)麥芽糖含量（微克）÷0.2（樣品容量：毫升）】×10（樣品稀釋倍數(shù)）=微克/毫升

 

注意事項(xiàng)

 

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液

2． 本產(chǎn)品適用于還原性、非還原性糖類、寡糖以及復(fù)雜性糖類，但不適合于氨基糖或脫氧糖及其衍生物

3． 本產(chǎn)品檢測范圍為0.2至50微克糖類總量

4． 本產(chǎn)品適用于96孔板操作，實(shí)際用量按比例減少

5． 操作時，須戴手套

6． 酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全

7． 孵育時，避免光照

8． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以稀釋樣品用量；注意在計算實(shí)際濃度時，不要忘記稀釋倍數(shù)調(diào)整

9． 糖類總量表述方式：微克麥芽糖/毫升；微克麥芽糖/細(xì)胞量；微克麥芽糖/總蛋白量

10． 本公司提供系列糖類檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感