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禽流感病毒檢測技術(shù)的研究新進展

2013-4-4　　閱讀(1401)

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禽流感（ＡＩ）是由Ａ型流感病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）的感染和／或疾病綜合癥。禽流感病毒屬正黏病毒科流感病毒屬，典型病毒粒子為球形，直徑８０～１２０ｎｍ，有時呈絲狀體等形態(tài)。至今已發(fā)現(xiàn)Ａ型流感病毒的血凝素（ＨＡ）有１６種，神經(jīng)氨酸酶（ＮＡ）有９種（傅生芳，２００５），根據(jù)表面糖蛋白ＨＡ和ＮＡ的抗原性差異可以分為１６個ＨＡ亞型和９個ＮＡ亞型，不同亞型病毒之間可以通過交換某些基因片段發(fā)生基因重排，出現(xiàn)具有新的生物學特征的病毒，因此，ＡＩＶ zui顯著的生物學特征之一就是亞型眾多。而且，不同亞型或血清型之間無交叉反應性或反應性低，這使得禽流感的診斷監(jiān)測工作較為困難。禽流感根據(jù)ＡＩＶ致病力的強弱可分為高致病性（ＨＰＡＩＶ）和低致病性（ＬＰＡＩＶ），前者不僅可以引起家禽死亡，還可以造成人的感染死亡，因此，控制ＡＩＶ的發(fā)生和流行具有重要意義。文章就禽流感近幾年的研究，尤其是在病原學檢測、免疫分
２．１　免疫傳感技術(shù)　
隨著生物傳感器的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了生物傳感器微陣列、微系統(tǒng)，該技術(shù)靈敏度高、響應快，不需要標記，既可定性又可定量，克服了傳統(tǒng)檢測方法費時、昂貴、標記及操作繁瑣等缺點，具有極廣泛的發(fā)展前景及臨床使用價值，成為生物傳感器領域的研究熱點（姚春艷等，２００６）。免疫識別膜的固定化技術(shù)是生物傳感器制作的核心部分，其固定化技術(shù)決定著生物傳感器的選擇性、靈敏度、穩(wěn)定性和壽命等主要性能，也決定著生物傳感器是否有研究和應用價值。詹愛軍等（２００９）將石英晶片諧振的高靈敏度與免疫反應的特異性相結(jié)合，用蛋白Ａ（ＳＰＡ）在鍍金膜的石英晶體電極偶聯(lián)抗Ｈ９亞型流感病毒的單抗構(gòu)建傳感器探頭形成免疫傳感器。檢測結(jié)果表明，該方法具有較好的特異性，不與Ｈ５亞型禽流感病毒和新城疫病毒（ＮＤＶ）反應，檢測靈敏度達到２０ＥＩＤ５０，組成的檢測器對相應的流感病毒響應良好，該法與雞胚病毒分離法檢出流感病毒的符合率達到９１％。林向華等（２００９）以ＡＴ切型、基頻１０ＭＨｚ的石英晶體為材料，設計四通道芯片微陣列。采用聚乙烯亞胺黏附—戊二醛交聯(lián)法
２．３　膠體金免疫層析法　
陳洪等（２００７）用膠體金顆粒標記Ｈ５ 亞型禽流感病毒單克隆抗體Ａ（Ｂ５Ｃ７），用羊抗鼠ＩｇＧ和Ｈ５亞型禽流感病毒單克隆抗體Ｂ（３Ｃ４）噴涂于硝酸纖維膜質(zhì)控線和檢測線上，研制出Ｈ５亞型禽流感病毒抗原金標快速診斷試紙條。用禽流感Ｈ
５、Ｈ９標準抗原和新城疫標準抗原作為檢測抗原對研制的試紙條進行特異性、敏感性和穩(wěn)定性試驗，試驗結(jié)果表明該方法操作簡單、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好，具有良好的應用前景。單抗介導的斑點免疫金滲濾法（ＤＩＧＦＡ）是利用Ａ型禽流感單克隆抗體和膠體金標記技術(shù)建立的快速檢測ＡＩＶ方法。敏感性高于ＨＡ診斷方法，２０～３０ｍｉｎ即可出結(jié)果，ＤＩＧＦＡ 具有不需試驗設備、可用肉眼判定、方法簡便、試劑用量少、對人體無害等優(yōu)點（雷彩俠，２００７）。

２．４　熒光抗體試驗
免疫熒光技術(shù)（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ，ＩＦＡ）是利用被標記上熒光色素的抗原（或抗體）特異性地與抗體（或抗原）結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應來進行觀察的檢測方法。zui早用于鑒定ＡＩＶ 的ＮＰ和ＭＰ抗原，１９６１年開始用于人類流感的快速診斷。秦愛建等（２００３）研制了抗禽流感Ｈ５和Ｈ９亞型病毒的單克隆抗體，建立了免疫熒光方法檢測ＡＩＶ，可以檢測出相應的Ｈ５亞型病毒。建立在單克隆抗體基礎上的免疫熒光方法具有快速、簡便、易行、較敏感等特點，也常用于臨床診斷，但出現(xiàn)假陽性的幾率較高。

 

２．６　酶聯(lián)免疫吸附試驗技術(shù)
酶聯(lián)免疫吸附試驗技術(shù)（ＥＬＩＳＡ）創(chuàng)立于１９７１年，１９７４年Ｊｅｎｎｉｎｇｓ等首先用ＥＬＩＳＡ對注射流感病毒所產(chǎn)生的抗體消長規(guī)律進行了檢測。ＥＬＩＳＡ具有較高的敏感性，既可以檢測抗體，又可以檢測抗原，且結(jié)果易于分析，在流感的控制、撲滅和檢疫中用途很大。Ｗｕ 等（２００７）運用表達的核蛋白（ＮＰ）建立了禽流感抗體定量間接ＥＬＩＳＡ檢測技術(shù)。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有成熟的禽流感抗原抗體檢測試劑盒出售，在ＡＩＶ流行病學普查及早期診斷上起到了重要的作用。李海燕
２．８　乳膠凝集試驗
乳膠凝集試驗（ＬＡＴ）主要用來檢測ＩｇＭ 抗體，其特點敏感性不如經(jīng)典的ＨＩ試驗，但由于不需要較高的試驗技術(shù)和特定的儀器設備，簡單、快速，可方便地用于臨床診斷和生產(chǎn)實踐。喻正軍等（２００５）以羧化的聚苯乙烯乳膠為載體，采用了共價偶聯(lián)的技術(shù)，經(jīng)雙功能試劑將ＡＩＶ的ＨＡ抗原表達產(chǎn)物和羧基化的乳膠共價偶聯(lián)起來，對血清中特異性ＨＡ抗體進行檢測，克服了蛋白質(zhì)致敏普通乳膠時，致敏抗原量少、不穩(wěn)定，致敏抗原上的蛋白質(zhì)容易脫落等缺點。此外，血凝及血凝抑制試驗（ＨＡ，ＨＩ）簡單、快速、特異性好，但敏感性較差，主要用于ＡＩＶ 亞型鑒定和病毒分離鑒定的輔助手段，不能直接檢測組織液和分泌液中的病毒，并且需要排除新城疫病毒、腺病毒等的干擾，且不能檢出病毒新的ＨＡ亞型。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗（ＮＩＴ）主要用于ＡＩＶ 的表面抗原神經(jīng)氨酸酶的亞型鑒定，雖不能提供常量法的定量，但卻是Ａ型流感病毒的分類和抗體檢測的快捷方法，被世界衛(wèi)生組織推薦用于ＮＡ 亞型的分類（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，２００８fs19 ）。ＮＩＴ成本較低且有可重復性，但試驗繁瑣，不易掌握，易受病毒ＨＡ抗體的干擾（任麗偉等，２００９）。病毒中和試驗（ＮＴ）是zui敏感且特異的血清學方法，檢出率也相當高，雖然它的操作繁瑣且耗時，但它高度的特異性是*的，很多新的檢測方法都要以之為標準來進行比較（楊帆，２００７）。
 
治療（Ａｍａｎｏ等，２００５）。時偉杰等（２００９）將Ｇ４ＰＡＭＡＭ 固定在玻碳電極表面，然后通過共價作用固定禽流感病毒探針ｓｓＤＮＡ－１，以［Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３］３＋為指示劑，采用示差脈沖伏安法和交流阻抗法對ＤＮＡ電化學生物傳感器進行了表征。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過與雙鏈ｄｓＤＮＡ作用的［Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３］３＋ 的峰電流信號的變化，可以識別和定量檢測溶液中互補的禽流感病毒ＤＮＡ 片段。經(jīng)過條件優(yōu)化，該法測定ＤＮＡ的濃度線性范圍為１．３×１０－９～６．５×１０－８ｍｏｌ／Ｌ，zui低檢測限為９．２×１０－１０?。恚铮欤獭?br />  
布在很小的載玻片等載體上，通過與標記的樣品進行雜交，檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中被檢分子的數(shù)量。曹三杰等（２００６）制備的ＮＤＶ－ＩＢＶＡＩＶ－ＩＢＤＶ診斷基因芯片質(zhì)量好，可對ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＡＩＶ和ＩＢＤＶ 進行診斷檢測，具有檢測靈敏性好，特異性高和芯片可重復檢測的優(yōu)點。試驗對３０個臨床樣品進行初步應用檢測，結(jié)果表明該診斷基因芯片技術(shù)與ＲＴ－ＰＣＲ檢測技術(shù)檢出率基本一致，并具有同步診斷檢測多種疫病的優(yōu)點。Ｘｕｅ等（２００８）通過設計ＡＩＶ?。玻祩€特異性引物和１個通用引物，經(jīng)ＲＴ－ＰＣＲ 或重疊ＰＣＲ 擴增了這２５ 個亞型的ｃＤＮＡ，研制出了一種能檢測禽流感１６個ＨＡ和９個ＮＡ的ＤＮＡ芯片。由于基因芯片技術(shù)特異、敏感且允許同時掃描成百上千的核苷酸序列，已成為一種具有巨大潛能的禽流感診斷方法。上已經(jīng)有關于基因芯片技術(shù)在流感亞型鑒別上應用的報道，直接檢測流感病毒的ｃＤＮＡ技術(shù)將作為流感病
３．４　核酸依賴的擴增　
核酸依賴的擴增（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ?。螅澹瘢酰澹睿悖澹猓幔螅澹洹。幔恚穑欤椋妫椋悖幔簦椋铮?，ＮＡＳＢＡ）是一種連續(xù)、等溫、基于恒溫反應的核酸擴增技術(shù)。該技術(shù)使用３種（禽類成肌細胞增多癥病毒反轉(zhuǎn)錄、核糖核酸Ｈ、噬菌體Ｔ７核糖核酸聚合酶）和２種特別設計的寡核酸引物。上游引物５′末端包含有噬菌體Ｔ７的依賴于ＤＮＡ的ＲＮＡ聚合的啟動子序列，下游引物的５′末端包含有和釕標電化學發(fā)光檢測探針（ＥＣＬ　Ｐｒｏｂｅ）互補的序列。在擴增步驟中，兩個５′端都整合進擴增序列中，從而率生產(chǎn)出互補ＲＮＡ序列的模板。該技術(shù)特點是整個擴增過程在恒溫條件下進行，不受背景中ＤＮＡ的干擾，不易發(fā)生交叉污染，擴增效率高于ＰＣＲ，特異性好，不需要特殊（如ＰＣＲ儀）的控溫裝置，檢測禽流感群特異性毒株（Ｈ１、Ｈ１５）（ＮＡＳＢＡ－ＡＩＶ）、Ｈ５亞型（ＮＡＳＢＡＨ５）、Ｈ７亞型（ＮＡＳＢＡ－Ｈ７）的ＮＡＳＢＡ／ＥＣＬ檢測
件下使引物順利與模板結(jié)合并進行鏈置換擴增反應。謝青梅等（２０１０）根據(jù)ＨＡ 基因保守區(qū)的序列，設計４條特異性引物進行核酸擴增，擴增后產(chǎn)物加入核酸染色劑ＳＹＢＲ?。牵颍澹澹睥窈停矗恚恚铮欤獭。停纾玻?，結(jié)果可視。擴增產(chǎn)物可用特異性內(nèi)切酶ＫｐｎⅠ進行酶切鑒定。用已建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技術(shù)檢測臨床樣品，檢測結(jié)果與ＲＴ－ＰＣＲ 方法一致。ＲＴＬＡＭＰ技術(shù)整個檢測過程只需１～２ｈ，不需要ＰＣＲ儀和成像系統(tǒng)，僅需要恒溫水浴鍋即可完成試驗。通過特異性、敏感性試驗，驗證了建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技術(shù)可以作為一種操作簡單，靈敏性、特異性高的檢測Ｈ５亞型禽流感病毒的方法。
 

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