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免疫學(xué)檢測法
閱讀:247 發(fā)布時(shí)間:2013-1-8免疫學(xué)檢測法的基本原理是細(xì)胞因子(或受體)與相應(yīng)的特異性抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合,通過同位素、熒光或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示,從而定性或定量顯示細(xì)胞因子(或受體)的水平。這類方法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期短,少受抑制物或相似生物池功能因子的干擾,如抗體的特異性高可區(qū)分不同型或亞型的細(xì)胞因子(如IFN),一次能檢測大量標(biāo)本,易標(biāo)準(zhǔn)化。與生物學(xué)活性檢測方法相比,免疫學(xué)檢測法在許多情況下敏感性低于前者,所得結(jié)果不表示生物學(xué)活性,有的McAb只能識別重組的細(xì)胞因子,在檢測天然的細(xì)胞因子中受到限制。
免疫學(xué)檢測法多采用ELISA和RIA法,可以分為平心法、競爭法和間接法。
(一)ELISA(或RIA)平心法
根據(jù)抗體性質(zhì)和特異性不同可有以下幾種不同的平心法ILISA。
1.PcAb與McAb夾心法 用純化的多克隆抗體(PcAb)包被板子,加待檢細(xì)胞因子(或可溶性受體)和標(biāo)準(zhǔn)品,上層加酶標(biāo)記的McAb。有時(shí)為了增加敏感性,上層加McAb后再用酶標(biāo)記第二抗體顯色。
2.McAb與PcAb夾心法 用McAb包被板子,加待檢樣品,上層加酶標(biāo)記的PcAb。有時(shí)為了增加敏感性,上層加PcAb后再用釗對PcAb的酶標(biāo)記抗抗體。
3.雙McAb夾心法 選擇和應(yīng)用識別同一個(gè)細(xì)胞因子(或受體)分子上不同表位的兩種McAb,其中一種包被板子,另一種McAb標(biāo)記酶。由于單克隆抗體親和力識別表位地勻一,從質(zhì)量控制角度來看,一般比上兩種夾心法易控制。如目前已商品化檢測細(xì)胞因子(或其受體)的檢測盒大多采用雙單克隆抗體夾心法。
4.細(xì)胞、McAb夾心法 用表達(dá)IL-2R的MT-1細(xì)胞包被板子,加入待檢IL-2或標(biāo)準(zhǔn)品,上層加125I標(biāo)記的McAb,根據(jù)γ計(jì)數(shù)cpm值推算出待檢IL-2含量。
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有報(bào)道用況爭法檢測IL-2水平。用免抗IL-2PcAb包袱板子,同時(shí)加入125I標(biāo)記的IL-2和待測IL-2,根據(jù)γ計(jì)數(shù)cpm值得知待檢IL-2對125I-IL-2與PcAb競爭結(jié)合的程度,從而推算出待測標(biāo)本IL-2的含量。這種方法檢測IL-2的敏感性可達(dá)50pg/ml。
為了增加敏感性,在上述系統(tǒng)中可再連接上生物素,再用鏈霉親和素(streptavidin)酶標(biāo)記物進(jìn)行放大。此外,還可用化學(xué)發(fā)光、改進(jìn)顯色底物等措施提高檢測方法的敏感性。