您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
【收藏】一文讀懂熒光定量PCR儀
要說2020年熱門研究領(lǐng)及檢測(cè)技術(shù)，非熒光定量PC莫屬。僅2020上半年，公開采購(gòu)PCR基因擴(kuò)增儀機(jī)構(gòu)數(shù)就是去年同期的2.5倍左右。今天，小析姐就和大家聊一聊常PCR的原理及相關(guān)技術(shù)，希望能對(duì)你的工作有所幫助。
PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，在1985年由美國(guó)Cetus公司的Kary Mullis，可以將微量目的DNA擴(kuò)增一百萬倍以上。Kary Mullis本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè),后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
一、熒光定量PCR原理
以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。開始時(shí)，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)不到熒光信號(hào)；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析，不能準(zhǔn)確定量，易造成污染出現(xiàn)假陽性，使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動(dòng)化程度高和無污染的特點(diǎn)，使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。
在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動(dòng)生成也可以手動(dòng)設(shè)置的。之后反應(yīng)會(huì)進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，這個(gè)期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性，在該期間，可設(shè)定一條熒光閾值線，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般會(huì)將熒光閾值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值，這個(gè)值與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性。
Ct值大的意義就是用來計(jì)算目的基因的表達(dá)量，此時(shí)就有兩個(gè)概念容易被提及，那就是定量和相對(duì)定量，定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。
Ct值誠(chéng)然可以被利用來計(jì)算這兩種定量結(jié)果，但是定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品制作困難難以獲取，實(shí)驗(yàn)室基本都是選擇相對(duì)定量的方法來計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。