1  前言

2013 年1 月，新西蘭牛奶及奶制品被檢測(cè)出含有低含量的有毒物質(zhì)雙氰胺（二氰二氨Dicyanodiamide，DCD），已經(jīng)下令禁售含有DCD的奶制品。中國(guó)的進(jìn)口奶粉八成來(lái)自新西蘭，60%以上的奶源產(chǎn)自新西蘭。新西蘭奶農(nóng)通常會(huì)在牧草上噴灑雙氰胺，防止肥料中的副產(chǎn)品硝酸鹽流入河流和湖泊。
 
目前，還沒(méi)有相應(yīng)的食品含量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。默克密理博致力于分析方法的開(kāi)發(fā)，為客戶(hù)提供簡(jiǎn)便、快速的解決方案。雙氰胺極性較強(qiáng)，易溶于水，中性及酸性條件下易電離，適合使用默克密理博的兩性離子型親水作用（ZIC®-HILIC）色譜柱分離。同時(shí)，雙氰胺在218nm下有強(qiáng)紫外吸收，可以采用ZIC®-HILIC 色譜柱在HPLC-UV條件進(jìn)行快速分析，亦可在LC-MS/MS進(jìn)行痕量檢測(cè)。
 

2 儀器及試劑

2.1 儀器設(shè)備

2.1.1 色譜柱：ZIC®-HILIC, PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm, 5 μm, 200 Å（1.50458.0001）
2.1.2 HPLC：Agilent 1260HPLC（DAD檢測(cè)器）
2.1.3 單道移液器Transferpette®S，Digital adjustable 500-5000ul（Brand：BR704782）
2.1.4 微孔濾膜:0.45um,PTFE（Millipore：SLFHX13NL）
2.1.5 純水系統(tǒng):Milli-Q3（Millipore）
2.1.6 PP離心管：50mL,帶蓋，含底座（貨號(hào):114822BR）

2.2 試劑

2.2.1 色譜乙腈:LichroSolv®Acetonitrile Gradient Grade（1.00030.4008）
2.2.2 乙酸銨：Ammonium acetate for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（1.01116.1000）
2.2.3 甲酸：Formic acid 98-100% for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（1.00264.1000）
2.2.4 2%甲酸溶液：取20ml甲酸，加入1000ml超純水中
2.2.5 乙腈-甲酸溶液：取700ml乙腈（2.2.1）,與300ml 甲酸溶液（2.2.4）混合

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 樣品處理

方法1:
取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管（2.1.6）中，加18mL 2%的甲酸水溶液，加蓋密閉。搖振60秒，再超聲30分鐘，取出，再搖振60秒，放入離心機(jī)中離心（4000轉(zhuǎn)），20分鐘。取出，吸取上清液50ul，于10ml PP管中，加入950ul乙腈，加蓋密閉，振搖60秒，吸取溶液，過(guò)濾，即得供試液。
方法2：
取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管中，加20mL 乙腈-甲酸水溶液（2.2.4），加蓋密閉。搖振60秒，再超聲30分鐘，取出，再搖振60秒，靜置，吸取上層溶液，過(guò)濾，即得供試液。
加標(biāo)樣品同法配制。

3.2 測(cè)試條件

3.2.1 色譜條件
流動(dòng)相 （v/v）: A-醋酸銨溶液（10 mM）,B-乙腈
比例*：A:B=12：88
流速:1 mL/min
進(jìn)樣量：20ul
*必要時(shí)設(shè)置如下方法對(duì)色譜柱進(jìn)行再生和平衡：

時(shí)間，min	%	%	流速 ml/min
0	12	88	1	等度
10	12	88	1	等度
10.5	30	70	2	再生
15	30	70	2	再生
15.1	12	88	2	平衡
20	2	88	2	平衡

3.3 測(cè)試結(jié)果
按照方法1處理，結(jié)果如下：
 3.3.1 對(duì)照品圖譜 
3.3.2 無(wú)檢出的奶粉空白3.3.3 奶粉加標(biāo)
3.3.4 某奶粉

4 結(jié)論

采用ZIC®-HILIC色譜柱，可用于雙氰胺的快速檢測(cè)。處理方法簡(jiǎn)單，色譜峰型良好，方法重現(xiàn)性良好（RSD<2%）,檢測(cè)濃度在0.5-10ug/ml之間現(xiàn)行關(guān)系良好（R=0.999）,加樣回收率在95.6-101.5%之間。按照方法1的處理，LOD為1.3ug/g奶粉，按照方法二處理,LOD可達(dá)0.07ug/g。
該色譜柱還能用于三聚氰胺、雙氰胺、三聚氰酸、二甲雙胍、尿素等的同時(shí)檢測(cè)，如：另外，LC-MS/MS采用如下色譜條件：
色譜柱：ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm
流動(dòng)相：A: 95:5 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O
B: 50:50 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O

梯度方法

Time （min）	Solution A （%）	Solution B （%）	Flow rate （mL/min）	Elution
0.0-5.0	100	0	0.400	isocratic
5.0-12.8	100-25	0-75	0.400	gradient
12.8-15.8	25	75	0.400	isocratic
15.8-16.0	100	0	0.400	equilibration
16.0-24.9	100	0	0.600	equilibration
24.9-25.0	100	0	0.400	equilibration

詳細(xì)方法可參考：

• FDA Laboratory Information Bulletin 4487
• Journal of Chromatography A 1220 （2012） 101–107

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