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PCR實驗應(yīng)當(dāng)注意的問題
點擊次數(shù)：2371 發(fā)布時間：2011-11-4
一、假陽性：
實驗中設(shè)立的陰性對照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現(xiàn)一個或幾個陽性結(jié)果，提示本次實驗中其它標本的檢測結(jié)果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品污染、擴增試劑污染、擴增產(chǎn)物交叉污染等。常見的污染來源包括實驗室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、 DNA抽提儀器、試劑及任何與擴增產(chǎn)物接觸的東西。預(yù)防措施：（1）工作區(qū)隔離。（2）改進實驗操作，如在加樣過程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。（3）操作程序合理化，如后加陽性對照等。
交叉污染的處理方法： 交叉污染指擴增產(chǎn)物對將要擴增的樣品或反應(yīng)管的污染。由于 PCR 的敏感性和效率特別高，所以少量的擴增產(chǎn)物污染標本或反應(yīng)管即可出現(xiàn)假陽性。交叉污染的處理方法包括 [1] ：
1 ．在 DNA 模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應(yīng)管內(nèi)容物以破壞污染的 PCR 產(chǎn)物。一般選用波長 254nm 照射 30min （ Nature ， 1990 ， 34:27 ）
2 ． PCR 實驗中使用 dUTP ，而不用 dTTP 。在擴增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）處理可降解交叉污染的 PCR 產(chǎn)物，而不降解基困組 DNA 模板，然后熱滅活此酶，再進行擴增反應(yīng)（ Gene ， 1990 ， 93 ： 125 ）。美國 PE 公司提供此類試劑盒（ PCR carry-over preventionkit 。
3 ．在 PCR 反應(yīng)前加入一種光化學(xué)試劑，反應(yīng)完成后激活該試劑，光化學(xué)試劑可交聯(lián) DNA 鏈，使之不能再擴增（ Nucleic Acids Res ， 1991 ， 19 ： 99 ）。
二、假陰性：
如果實驗中設(shè)置的陽性對照未能擴增成陽性結(jié)果，提示本次實驗中可能有假陰性結(jié)果。但這里應(yīng)注意，許多國產(chǎn) PCR 試劑盒中陽性對照采用質(zhì)粒 DNA ，和標本相比來說，不需純化提取核酸的步驟，因此，如果在標本核酸純化提取步驟有問題，即使陽性對照均呈陽性，標本檢測中還可能有假陰性。
造成假陰性的原因包括: （1） DNA 抽提過程不當(dāng)。 （2） DNA 樣品中含有 Taq 聚合酶抑制劑，如尿素、 DMSO 、SDS 等物質(zhì)，可抑制 Taq 酶活性， DNA 樣品中的蛋白質(zhì)和重金屬離子等亦影響 Taq 酶活性，尤其是含有較多膿液或分泌物的標本，其中雖有待查菌，但卻因標本處理不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性 [2] 。 設(shè)置內(nèi)對照是判斷假陰性較好的指示系統(tǒng)。在每一反應(yīng)管中加入內(nèi)對照，若內(nèi)對照未能擴增出來，說明該反應(yīng)管的結(jié)果可能有問題。
三、PCR產(chǎn)物的鑒定
PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳可判斷其長度是否為預(yù)期的長度，但只有通過雜交試驗或序列分析等才能判斷其特異性。嚴格說來， PCR 產(chǎn)物均應(yīng)通過實驗證實其特異性。在我國一些科研論文和臨床檢測中缺乏這一環(huán)節(jié)。
綜上所述， PCR 具有其優(yōu)點，但也有不足之處，它是一種很好的科研手段，但作為常規(guī)診斷方法尚需進一步改進和提高 [9] 。目前的關(guān)鍵問題是如何正確應(yīng)用 PCR 。雖然 PCR 尚未在包括美國等發(fā)達國家作為常規(guī)診斷方法，但如果具備開展 PCR 需要的條件，PCR 是可作為輔助診斷手段使用的。目前，只有針對 PCR 應(yīng)用中存在的問題，采取措施，正確應(yīng)用 PCR ，才能使這一技術(shù)在科研和臨床工作中發(fā)揮應(yīng)有的作用。