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冰王燒燙膏對(duì)大鼠深Ⅱ度燒傷的修復(fù)及機(jī)制研究
馮啟凱1，曲梅花1，季萬勝2，李 艷1，辛 亭1，黎瀚文1，劉鳳嬌1
( 1． 濰坊醫(yī)學(xué)院，山東省高校應(yīng)用藥理學(xué)重點(diǎn)強(qiáng)化建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261053;2． 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊 261031)基金項(xiàng)目: 國(guó)家教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金( 2011 年第 43批)
作者簡(jiǎn)介: 馮啟凱，男，碩士研究生
通信作者: 曲梅花，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向: 神經(jīng)內(nèi)分泌
藥理學(xué)，E-mail: qumeihua@ hotmail． com

摘要: 目的 研究探討冰王燒燙膏對(duì)大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的修復(fù)及機(jī)制。方法 雄性 Wistar 大鼠 60 只，制備深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的大鼠模型后，隨機(jī)分為燒燙膏組、京萬紅組、燒傷模型組，每組 20 只。測(cè)量大鼠燒傷后 1、3、7、13、21 d 皮膚創(chuàng)面的愈合率和血清 TNF-α 含量; 燒傷后 4d 免疫熒光法測(cè) glut-2 受體的表達(dá)變化。結(jié)果 燒傷后 1 d 各組創(chuàng)面愈合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞ 0． 05) ，7、13、21 d 燒燙膏能明顯縮短燒傷大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的時(shí)間，提高愈合率( P ＜ 0． 01) 。燒傷后 1、3、7、13、21 燒燙膏組大鼠血清 TNF-α 水平呈明顯下降，與模型組比較差異有顯著性( P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01) 。和模型組比較，燒燙膏組 glut-2 受體表達(dá)數(shù)目增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 01) 。結(jié)論 冰王燒燙膏對(duì)燒傷皮膚創(chuàng)面具有良好的修復(fù)作用并可能與降低血清 TNF-α 水平和增加 glut-2 受體表達(dá)有關(guān)。
關(guān)鍵詞: 燒燙膏; 燒傷; 創(chuàng)面愈合; TNF-α; glut-2 受體; 熒光抗體反應(yīng)

冰王燒燙膏系運(yùn)用白礦油、白芝麻油、冰片等為主藥制備而成的一種外用中藥復(fù)合乳劑，在燒傷臨床沿用多年，具有促進(jìn)表皮細(xì)胞、組織細(xì)胞再生，有效避免瘢痕形成，減輕燒燙傷對(duì)皮膚的損傷度的功效，然而其作用機(jī)制一直未明。本實(shí)驗(yàn)通過觀察冰王燒燙膏對(duì)大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)的治療作用，探討其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步促進(jìn)其在臨床廣泛推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1． 1 材料
1． 1． 1 試驗(yàn)動(dòng)物 雄性 Wistar 大鼠 60 只，SPF 級(jí)，重量 200 ～ 220 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，許可證號(hào): SCXK 魯 20130001。
1． 1． 2 主要試劑和試驗(yàn)儀器 冰王燒燙膏( 平輿冰王生物工程有限公司，批號(hào) 20140105) ; 京萬紅
( 天津 達(dá) 仁 堂 京 萬 紅 藥 業(yè) 有 限 公 司，國(guó) 藥 準(zhǔn) 字Z12020440，批號(hào) 211897) ; 硫化鈉( 天津博迪化工股份有限公司) ; 腫瘤壞死因子-α 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒( 上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司) ; Anti-Glut-2R ( 北京博奧森生物技術(shù)有限公司) ; 高速冷凍離心機(jī)( 德國(guó) SIGMA 公司) ; 奧林巴斯 IX71 顯微鏡( 日本奧林巴斯公司) 。
1． 2 試驗(yàn)方法
1． 2． 1 大鼠分組及背部燒傷模型的制備 wistar雄性大鼠 60 只，隨機(jī)分為三組即燒燙膏組，京萬紅
組，燒傷模型組，每組 20 只。用 8% 硫化鈉溶液在實(shí)驗(yàn)前 24 h 對(duì)大鼠背部?jī)蓚?cè)皮膚進(jìn)行脫毛，脫毛面積 5 cm × 6 cm 左右，約 1 min 后用水充分清洗脫毛區(qū)，以防過度刺激皮膚。用 3% 戊ba比妥鈉( 40 mgkg － 1) 腹腔麻醉后將大鼠四肢盡量伸展，于俯臥位固定在木質(zhì)操作板上。室溫下，將注滿沸水直徑4 cm 一端無堵頭的中空大離心管直立于大鼠脫毛部，與皮膚緊密接觸且保證水不流出。沸水與皮膚持續(xù)接觸 15 s，將操作板及大鼠連同塑料管迅速翻轉(zhuǎn)，造成深Ⅱ度燒傷模型( 經(jīng)病理組織學(xué)檢查) ，立即腹腔內(nèi)注射乳酸鈉林格氏液 5 mL 抗休克［1］。
1． 2． 2 創(chuàng)面處理及給藥 燒燙膏組、京萬紅組每天早中晚 3 次分別涂以燒燙膏和京萬紅; 模型組在
相同時(shí)段涂無菌生理鹽水。總給藥時(shí)間持續(xù) 4 周。為防其舔舐傷口，所有大鼠造模后均在其頭頸部套
自制紙硬殼項(xiàng)圈。在給藥期間，所有大鼠單獨(dú)分籠飼養(yǎng)，自由飲水并給予普通飼料喂養(yǎng)。
1． 2． 3 觀察指標(biāo) ( 1) 大體觀察每次換藥時(shí)肉眼對(duì)比觀察各組燒傷創(chuàng)面水腫滲出程度，是否有分泌
物及創(chuàng)周紅腫等。( 2) 觀察創(chuàng)面愈合率按照 Nagelschmidt 法，于燒傷后不同時(shí)間用透明塑料薄膜覆
蓋于大鼠創(chuàng)面描記創(chuàng)面邊緣，用規(guī)格相同紙殼按照描記的邊緣剪下同樣大小的面積進(jìn)行稱重。創(chuàng)面
愈合判斷標(biāo)準(zhǔn)是痂皮自行脫落且有新生上皮形成。以燒傷第 1 天的面積作為原始面積，以后各時(shí)間點(diǎn)
測(cè)量的面積均和原始面積比。創(chuàng)面的面積轉(zhuǎn)換為紙殼的重量，計(jì)算公式如下:創(chuàng)面愈合面積百分比 = ( 原始燒傷面積 － 各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積) /原始燒傷面積 × 100% 。記錄實(shí)驗(yàn)后 1、3、7、13、21 d 各組大鼠創(chuàng)面愈合情況并對(duì)各組大鼠創(chuàng)面的平均愈合天數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。
1． 2． 4 TNF-α 的檢測(cè) 各組隨機(jī)選取大鼠 10 只于燒傷后 1、3、7、13、21 d 經(jīng)眼內(nèi)眥采集靜脈血 1 mL，室溫靜置于離心管 15 min 自凝，3 000 r·min － 1( r= 16 cm) ，離心 10 min 后取上層血清，于 － 80℃ 保存?zhèn)溆?。血清中?TNF-α 表達(dá)水平用 ELISA 法檢測(cè)，具體按說明書所述方法操作。
1． 2． 5 Glut-2 受體的表達(dá) 燒傷后 4 d 各組隨機(jī)選取大鼠 10 只頸椎脫臼處死，取末端回腸 2 ～ 3
cm，于 4% 多聚甲醛固定 24 h，石蠟切片，抗原修復(fù)，封閉，37℃ 孵 育 1 h，Glut-2R ( 兔 抗 鼠，1 ∶ 200 ) +0． 03% TritonX-100 室溫過夜，PBS 漂洗，熒光二抗FITC( 山羊抗兔，1∶ 200) ，37℃ 避光孵育 1． 5 h，PBS漂洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取 10個(gè)高倍視野( 200 × ) ，記錄每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)目，取其平均值。
1． 2． 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x± s) 表示，用 SPSS13． 0 進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗(yàn)的方法，P ＜ 0． 05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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