五月婷网站,av先锋丝袜天堂,看全色黄大色大片免费久久怂,中国人免费观看的视频在线,亚洲国产日本,毛片96视频免费观看

螢火蟲(chóng)(Photinus pyralis)熒光素酶已被證實(shí)是檢測(cè)啟動(dòng)子活性和監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控狀態(tài)的理想的報(bào)告基因。它是在細(xì)胞質(zhì)中作用的酶，分子量61kDa并催化下列反應(yīng)：
 

以前，應(yīng)用螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)遺傳因子上調(diào)是比較容易的。但是由于檢測(cè)量綱對(duì)基因的下調(diào)表達(dá)定量過(guò)于狹窄，而且例如細(xì)胞死亡等非特異因素能降低熒光素酶，它并不是很適合于研究基因表達(dá)的下調(diào)。因此，通過(guò)以單個(gè)參比報(bào)告基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)均一化實(shí)驗(yàn)中所用的報(bào)告基因就成為區(qū)分特異和非特異細(xì)胞應(yīng)答效果影響的有效方法。均一化方法同樣是協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)染效率差異和細(xì)胞活力差異的有效方法。

用亮度計(jì)或熒光讀取儀可以發(fā)現(xiàn)：發(fā)出熒光的光強(qiáng)和熒光素酶的數(shù)量成正比例關(guān)系。以前，應(yīng)用螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)遺傳因子上調(diào)是比較容易的。但是由于檢測(cè)量綱對(duì)基因的下調(diào)表達(dá)定量過(guò)于狹窄，而且例如細(xì)胞死亡等非特異因素能降低熒光素酶，它并不是很適合于研究基因表達(dá)的下調(diào)。因此，通過(guò)以單個(gè)參比報(bào)告基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)均一化實(shí)驗(yàn)中所用的報(bào)告基因就成為區(qū)分特異和非特異細(xì)胞應(yīng)答效果影響的有效方法。均一化方法同樣是協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)染效率差異和細(xì)胞活力差異的有效方法。

螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于協(xié)同報(bào)告并進(jìn)行均一化研究。由于它們都是快速，容易和高靈敏的監(jiān)測(cè)方法。而且螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶是理想的雙基因報(bào)告系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈儊?lái)源于不同的生物進(jìn)化方向，蛋白結(jié)構(gòu)和底物差異都很大，在實(shí)驗(yàn)中不會(huì)產(chǎn)生相互影響。

GeneCopoeia充分利用了螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶結(jié)構(gòu)和底物的不同，優(yōu)化并開(kāi)發(fā)了方便的檢測(cè)體系可以方便連續(xù)地定量測(cè)定兩種熒光素酶的活性。兩種酶酶活活性的檢測(cè)可以依次在同一樣品里檢測(cè)出。螢火蟲(chóng)熒光素酶的熒光可以被一種試劑激發(fā)，并且第二種試劑可同時(shí)淬滅螢火蟲(chóng)熒光素酶的熒光和激發(fā)海腎熒光素酶酶的熒光。

GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Kit開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)給該產(chǎn)品帶來(lái)了幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，可以增強(qiáng)產(chǎn)品的性能和增加產(chǎn)品的方便性。使用者可以充分感覺(jué)到以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：

1. 該系統(tǒng)已在好幾種不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)試，經(jīng)過(guò)優(yōu)化處理可適合高通量監(jiān)測(cè)儀器的micro-plate探頭，單孔樣品同樣可以被監(jiān)測(cè)。
    
2. 該系統(tǒng)只能產(chǎn)生非常微弱的背景熒光(圖1)。從讀取數(shù)值可知：沒(méi)有差異值是必需的。

   圖表 1 GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Assay的熒火蟲(chóng)熒光素酶具有低背景的特點(diǎn)

3. 工作溶液I (溶液I中含有底物I)還有所有和裂解細(xì)胞有關(guān)的組分，并添加了可在同一反應(yīng)液中與螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)的底物和穩(wěn)定劑。
4. 海腎熒光素酶緩沖液含有淬滅螢火蟲(chóng)熒光素酶活性的成分。(圖2)
   

   圖表 2 加入溶液II后，螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性被淬滅。在6孔板中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)染pEZX-MT01 質(zhì)粒(miRNA的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染18小時(shí)后，把HEK293細(xì)胞移到96孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)激發(fā)熒光。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，96孔板的酶活依次被檢測(cè)。檢測(cè)完成后，只加溶液II(沒(méi)有底物II)到右邊半板的孔中。整塊板在Victor II機(jī)器上再次讀取熒光，大約95%的螢火蟲(chóng)熒光素酶的熒光被淬滅。

   
   
    
5. 試劑經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化改進(jìn)后，可以使得螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶的信號(hào)相對(duì)穩(wěn)定(圖3)。22°C加入適當(dāng)試劑后30分鐘，螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性才只有原來(lái)的80%，而海腎熒光素酶的活性15分鐘后才為原來(lái)的80%。
   

   圖表 3 GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Assay螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的信號(hào)的穩(wěn)定性。在6孔板中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)染pEZX-MT01 質(zhì)粒(miRNA的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染18小時(shí)后，把HEK293細(xì)胞移到96孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)激發(fā)熒光。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，96孔板的酶活依次被檢測(cè)。某A 公司的雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒用作參比。圖3a：螢火蟲(chóng)熒光素酶的酶活信號(hào)；圖3b海腎熒光素酶的酶活信號(hào)。

   
   
   
   
   

    

6. 該系統(tǒng)被設(shè)計(jì)和優(yōu)化出在多個(gè)數(shù)量級(jí)別范圍內(nèi)穩(wěn)定可信的熒光值和質(zhì)粒濃度間穩(wěn)定的線性結(jié)果。

   (a)	(b)

   圖4 檢測(cè)到的激發(fā)熒光(熒光酶酶活的度量)和轉(zhuǎn)化到HEK293 細(xì)胞中熒光素酶 質(zhì)量的線性關(guān)系。 HEK293細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)染不同質(zhì)量梯度(如圖所示)的GeneCopoeia pMRO or pEZX-MT01 質(zhì)粒(miRNA的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染18小時(shí)后，把HEK293細(xì)胞移到96孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)激發(fā)熒光。如圖所示：通過(guò)pMRO質(zhì)粒檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶的酶活(圖：4a)；通過(guò)pEZX-MT01質(zhì)粒檢測(cè)海腎熒光素酶的酶活(圖：4b)。

   
   
7. 可檢測(cè)3' UTR靶標(biāo)克隆上靶標(biāo)受到特定miRNA的抑制效應(yīng)(圖：5)。HEK293細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)染1.0 mg的 3' UTR表達(dá)克隆 (pEZX-MT01-Lin28 UTR-fLuc)和 1.4 mg的miRNA 表達(dá)克隆(或 miRNA 參照質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染18小時(shí)后，把HEK293細(xì)胞移到96孔板中培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)Victor II儀器定量檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶酶活。螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶酶活以海腎螢光素酶酶活為基準(zhǔn)進(jìn)行均一化。
    

   圖表 6 在293T細(xì)胞里foskolin誘導(dǎo)的依賴CRE的熒光素酶表達(dá)

8. 在293T細(xì)胞里foskolin誘導(dǎo)的依賴CRE的熒光素酶表達(dá)(圖：6)。 螢火蟲(chóng)熒光素酶基因可以被CRE元件控制(cAMP應(yīng)答控件)，該基因被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞系后，細(xì)胞在96孔板里培養(yǎng)一天后，體系用不同濃度的foskolin(FSK，乙酰環(huán)化酶激活子)再處理16個(gè)小時(shí)。通過(guò)Victor II儀器定量檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶。(該實(shí)驗(yàn)不涉及海腎熒光素酶的酶活)