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人外血淋巴細(xì)胞玻片制備程序詳解
閱讀：1175 發(fā)布時(shí)間：2016-1-12
(1)標(biāo)本采集。用肝素潤(rùn)濕的針筒采骨髓/外周血2-4ml，培養(yǎng)按步驟(2)操作，不培養(yǎng)按步驟(3)操作。（進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)一般采用肝素抗凝）
(2)培養(yǎng)法：混勻后注入兩瓶含5ml培養(yǎng)液的標(biāo)本瓶中，每瓶0.3～0.5ml；每瓶中加入PHA0.2ml，孵箱中培養(yǎng)24-72小時(shí)，每日早晚各搖勻一次；阻斷中期分裂相，與終止培養(yǎng)前2-4小時(shí)加入秋水仙素，終濃度為0.1μg/ml。
(3)不培養(yǎng)：提取有核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞分離液或去除紅細(xì)胞，或按照常規(guī)方法）（如實(shí)驗(yàn)不需要染色體分裂相，可選用不培養(yǎng)法，步驟較簡(jiǎn)單；如果實(shí)驗(yàn)需要在染色體分裂相上進(jìn)行，可選用培養(yǎng)法）
(4)收獲細(xì)胞。PBS洗，1200rpm，離心10分鐘。重復(fù)步驟（4）。（在離心后,吸去上清液時(shí),請(qǐng)注意上清中是否有油滴存在,如有,應(yīng)盡量吸去油滴）
(5)低滲。吸去上清液，加入6～8ml預(yù)熱至37℃的0.075mol/lKCl溶液，吹打懸浮細(xì)胞，37℃水浴溫育20分鐘，期間吹打2－3次。（低滲液是指滲透壓和離子強(qiáng)度均低于正常細(xì)胞生理?xiàng)l件的溶液，例如水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、氯化鉀等。低滲效果取決于低滲液的化學(xué)組成、低滲的溫度和處理時(shí)間。低滲處理是憑借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展。該步驟的目的是使細(xì)胞盡量膨脹，理想狀態(tài)是胞膜脹破得到裸露的細(xì)胞核）
(6)預(yù)固定。直接于細(xì)胞低滲混合液中緩慢加入2ml固定液，混勻。
(7)1200rpm，離心10分鐘。
(8)固定。去上清，加入6～8ml固定液，混勻。靜置10分鐘
(9)1200rpm，離心10分鐘。
(10)重復(fù)步驟(8)和(9)。（細(xì)胞在低滲處理后處于較脆弱的狀態(tài)，固定的目的是讓細(xì)胞保持在這一狀態(tài)）
(11)細(xì)胞懸液的制備和保存。去上清，根據(jù)細(xì)胞量加適量固定液，制成濃度合適的細(xì)胞懸液?；靹蚝蟮纹?。此細(xì)胞懸液置-20℃冰箱中可保存1個(gè)月。在此期間可隨時(shí)取出，離心去上清加入新鮮固定液，制片供FISH檢測(cè)之用。（新鮮的標(biāo)本容易得到好的雜交信號(hào)，建議使用新鮮標(biāo)本。）
（12）制片。用吸管將細(xì)胞懸液輕輕吹打混勻后吸取少量，滴至干凈的載玻片上，自然晾干。剩余標(biāo)本置于-20℃冰箱備用。（根據(jù)明場(chǎng)顯微鏡下觀察確定合適的細(xì)胞密度）
（13）老化玻片。室溫放置過(guò)夜或56℃烤片至少30分鐘。玻片放入玻片盒中，室溫干燥保存。建議不要將制好的片子放置太久，否則會(huì)影響信號(hào)的質(zhì)量。通常情況下，片子老化后馬上進(jìn)行檢測(cè)。（玻片老化時(shí)間或溫度不足會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)嚴(yán)重細(xì)胞脫落現(xiàn)象）