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淺析倒置熒光顯微鏡在活體細胞成像中的應用
閱讀：776 發(fā)布時間：2019-9-5
在活體細胞成像應用中，寬場倒置熒光顯微鏡有助于觀察放置于顯微鏡載物臺上特定的環(huán)境室中生長的粘附細胞的動力學特性。在基本的配置中，配備有EPI熒光照明的標準倒置組織培養(yǎng)顯微鏡與區(qū)域陣列檢測器系統(tǒng)（通常是CCD攝像機）、合適的熒光濾色片和光閘系統(tǒng)耦合，以限制細胞過度暴露于有害的激發(fā)光?；镜怪脽晒怙@微鏡依靠精心匹配的干涉濾色片來選擇特定的帶寬用于照明和檢測發(fā)射光。光源包括汞、氙氣和金屬鹵化物弧光燈、光束擴展激光系統(tǒng)和發(fā)光二極管（LED），所有這些都需要不同的濾色片規(guī)格。用于倒置熒光顯微鏡的合成熒光團具有覆蓋近紫外、可見和近紅外區(qū)域的發(fā)射光譜?；蚓幋a熒光蛋白的應用極大地擴展了倒置熒光顯微鏡在活細胞成像中的能力，使研究人員能夠地瞄準感興趣的亞細胞區(qū)域。
在寬場熒光中，倒置熒光顯微鏡物鏡收集的全孔徑發(fā)射光可以使記錄的信號大化，同時使所需的曝光時間小化。因此，樣本可以用非常短的光照周期成像。寬場成像的主要缺點是，從遠離焦平面的區(qū)域產(chǎn)生的熒光以及背景信號都是沒用的光，這些光通常會使感興趣的特征模糊。因此，當感興趣的特征很大（如細胞器）或本質(zhì)上具有高度點狀時，寬場成像可獲得*結果。各種各樣的活細胞樣本，包括粘附細胞、細菌、酵母和非常薄的組織切片，是寬場熒光成像的理想候選，然而，較厚的組織（超過5微米）使用更*的方法成像。
盡管合成熒光染料、量子點和熒光蛋白在熒光成像方面有許多進展，但在某些情況下，將熒光與其他成像方式結合起來是很有幫助的。舉個例子，DIC可與寬場熒光結合使用，以監(jiān)測細胞活力和一般形態(tài)，同時研究特定標記目標的感興趣的現(xiàn)象。在單張圖像中采集DIC和熒光通常是不切實際的，但在合適配置的顯微鏡中，這兩種技術可以依次使用。因此，在落射熒光模式下成像后，可以使用透射光，從熒光標記的樣本中采集DIC圖像。這兩個圖像可以在后期分析過程中合并。*的寬場顯微鏡配置中可以使用光譜分離照明（如可見光和近紅外）和雙攝像頭或分視圖攝像頭適配器同時采集DIC和熒光圖像。在大多數(shù)激光掃描共聚焦顯微鏡中，可以同時以熒光和DIC模式獲取圖像，從而消除了對采集后處理的需要。也可以與寬場倒置熒光顯微鏡結合使用。然而，在這些技術中，物鏡都是特殊的，無論是相位環(huán)還是霍夫曼調(diào)制板，都會導致5-15%的發(fā)射強度損失。
需要注意的是，當將DIC、相差或霍夫曼調(diào)制對比與熒光結合時，尤其是在活細胞成像中，通過DIC偏光器、物鏡相位環(huán)或物鏡后焦平面上的霍夫曼調(diào)制板的發(fā)射光損失可能很嚴重。在前一種情況下，在采集熒光圖像之前，應將DIC偏光器和Nomarski棱鏡從光路中移除，但相差物鏡和霍夫曼物鏡包含不能移除的光學元件。通過相位環(huán)或霍夫曼調(diào)制器的光損耗不如通過偏光器的光損耗嚴重，并且不會影響許多應用。然而，在使用弱熒光探針染色或具有低豐度目標的樣本中，使用高透過率物鏡獲得靈敏度增益是至關重要的。