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星形膠質(zhì)細(xì)胞在降鈣素中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制中的作用 *

李海英 1 △ 肖 智 2 △ 李樹法 3向 菲 4 王 青 1

（1 貴陽(yáng)市第yi人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴陽(yáng) 550002；2 遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，遵義 563003；3 臨沂市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，臨沂 276000；4 貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴陽(yáng) 550081）

摘 要 目的：觀察降鈣素（sCT）對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）星形膠質(zhì)細(xì)胞 D-絲氨酸（D-Ser）釋放的影響，明確星形膠質(zhì)細(xì)胞在 sCT 鎮(zhèn)痛中作用機(jī)制。方法：72 只雄性 SD 大鼠建立坐骨神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型后，隨機(jī)分為 6 組 (n = 12)：正常組、CCI 組、sCT 組、射氟代檸檬酸 (FCA) 組、苯甲酸鈉 (SB) 組和 7- 氯犬尿酸 (CK) 組。除正常組及 CCI 組外大鼠均腹腔內(nèi) sCT。von Frey 纖維檢測(cè)其機(jī)械痛閾值 (MWT)，ELISA 法檢測(cè)其 PAG 中 D-Ser 水平。結(jié)果：建模后大鼠 MWT 下降，給予腹腔注射 sCT 后，D-Ser 水平和 MWT 顯著上升（P 均 < 0.001）；PAG 注射 FCA 或 SB，分別引起 sCT 治療大鼠 D-Ser 水平和 MWT 下降或上升（P 均 < 0.001）；PAG 注射CK 引起 sCT 治療大鼠 MWT 下降（P < 0.001），D-Ser 水平無(wú)變化。結(jié)論：sCT 引起神經(jīng)病理性疼痛大鼠 PAG 星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，D-Ser 釋放增加，增強(qiáng) NMDA 受體功能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

關(guān)鍵詞 降鈣素；星形膠質(zhì)細(xì)胞；D- 絲氨酸；中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)；神經(jīng)病理性疼痛既往認(rèn)為，哺乳動(dòng)物體內(nèi)無(wú)D-絲氨酸（D-serine，D-Ser）存在。隨后研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物（大鼠）大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中有 D-Ser 和 D-Ser 消旋酶（serine racemase，SR）存在，且活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可釋放 D-Ser，近年發(fā)現(xiàn)除了星形膠質(zhì)細(xì)胞（主要），神經(jīng)元也可以釋放 D-Ser[1]。合成和降解 D-Ser 的酶分別是 SR 和 D- 氨基酸氧化酶 (D-amino acid oxidase，DAAO)。D-serine 可以作為共激動(dòng)劑 (co-agonist)，與 N- 甲基 -D- 門冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate，NMDA）的 NR1 亞基的“甘氨酸位點(diǎn)”進(jìn)行結(jié)合，是調(diào)節(jié) NMDA 受體活性及神經(jīng)毒性的關(guān)鍵因子，因此膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)突觸小泡形式釋放 D-Ser 與 NMDA受體作用實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié) [2]。中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（periaqueductal gray，PAG）接受來(lái)自外周的疼痛信息，同時(shí)也接受高位中樞的疼痛調(diào)制信息，是機(jī)體內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，近年發(fā)現(xiàn)，PAG 也是機(jī)體下行性疼痛易化系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸 (glutamate, Glu) 及其受體在疼痛調(diào)制中作用重大。脊髓和外周，Glu 水平的提高和 / 或 NMDA 受體的活化可產(chǎn)生致痛作用，而在脊髓上結(jié)構(gòu)，Glu 水平的提高和 / 或NMDA 受體的活化可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。研究證實(shí)：大鼠 PAG 中微量注射 NMDA 產(chǎn)生強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，而 NMDA 受體拮抗劑 D-AP7 可減弱此鎮(zhèn)痛作用，說(shuō)明 PAG 中 NMDA 受體的活化將產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用 [3]。如前所述，D-Ser 是 NMDA 受體甘氨酸位點(diǎn)的激動(dòng)劑，其激動(dòng)作用強(qiáng)于 Gly。Martins 研究發(fā)現(xiàn) [4]：PAG 微量注射 Gly 可劑量依賴的提高大鼠甩尾反射閾值，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，那么很有可能 PAG 中 D-ser的增多也可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。結(jié)合前期研究 [5]：對(duì)慢性神經(jīng)病理性疼痛（CCI 模型）大鼠 PAG 微量注射鮭魚降鈣素 (salmon calcitonin，sCT) 后，CCI 大鼠疼痛行為緩解，機(jī)械痛閾 (mechanical withdrawal thresholds，MWT) 和熱痛閾上調(diào)，那么 sCT 在 PAG的鎮(zhèn)痛機(jī)制是否也包含 D-Ser 的介入呢？本研究將通過(guò)腹腔注射 sCT 后，觀察 PAG 中 D-Ser 水平變化以及其變化對(duì) sCT 鎮(zhèn)痛作用的影響。

方 法

1. 材料

（1）動(dòng)物：雄性清潔級(jí) SD 大鼠 72 只，體質(zhì)量 210 ～ 220 g，由遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK（黔）2011-003。在安靜、溫度 24±2℃、濕度 60%±5%、明暗各 12 h (8AM-8PM) 周期環(huán)境中飼養(yǎng)，每籠 4 ～ 5 只。大鼠自由飲食和飲水。隨機(jī)分為正常組、CCI 組、sCT 組、氟 代 檸 檬 酸 (fluorocitrate, FCA) 組、7- 氯 犬 尿 酸(7-chlorokynurenate，CK) 組、 苯 甲 酸 鈉 (sodium benzoate，SB) 組，每組 12 只。建模后 14 d，每組大鼠各隨機(jī)取 6 只，ELISA 法檢測(cè) PAG 中 D-Ser 水平，余下 6 只繼續(xù)觀察機(jī)械痛閾變化，直到建模后21 d。sCT 組大鼠從 CCI 手術(shù)后 1 d 開始，每日給予 sCT（2 µg/(kg.d)，i.p.），直到手術(shù)后 21 d 實(shí)驗(yàn)結(jié)束。FCA 組、7-CK 組和苯甲酸鈉組取 CCI 建模并經(jīng) sCT 腹腔注射 14 d 大鼠，分別在大鼠 PAG 微量 注 射 FCA (1.2 µg/0.3 µl)、SB (150 µg/0.3 µL) 和7-CK (3.6 µg/0.3 µL)，觀察大鼠機(jī)械痛閾以及 D-Ser水平變化。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照疼痛學(xué)會(huì) (IASP) 關(guān)于應(yīng)用動(dòng)物進(jìn)行疼痛研究的倫理綱要進(jìn)行操作。

（2） 試 劑：sCT（ 美 國(guó) Sigma 公 司）， 溶 于0.001N 醋酸 , 終濃度 1 µg/ml； FCA（美國(guó) Sigma公司）, 溶于生理鹽水，終濃度 4 mg/ml；SB（美國(guó)Sigma 公司）溶于生理鹽水，終濃度 500 mg/ml；7-CK（美國(guó) Sigma 公司）溶于含 5% 二甲基亞砜（DMSO）的 PBS 溶液，終濃度 12mg/ml；腦立體定位儀（日本 Narishige 公司）；微量進(jìn)樣器 (5 µl，寧波鎮(zhèn)海玻璃儀器廠 )；D-serine 酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭，Labsystems Multiskan MS 352 型）；洗板機(jī)（芬蘭Thermo Labsystems，AC8 型）； 電 子 Von Frey 測(cè)痛儀（2390 系列，美國(guó) IITC Life Science）

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