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G-Rex懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)-T細(xì)胞

G-Rex懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)使用特點：

★ 一次性加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)10天，細(xì)胞擴(kuò)增100倍。不需要反復(fù)換液和操作細(xì)胞

★ 靜置培養(yǎng)，普通的培養(yǎng)箱即可進(jìn)行

★ 培養(yǎng)瓶與儀器配合，以半自動方式進(jìn)行細(xì)胞回收

★ 生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞與傳統(tǒng)方法相比表達(dá)CD62L和CD25的比例更高，抗腫瘤活性更強

★ 封閉系統(tǒng)，滿足GMP生產(chǎn)要求

G-Rex透氣型培養(yǎng)容器截面說明圖：

系統(tǒng)組成：

1、GatheRex 細(xì)胞回收控制器  

2、G-Rex培養(yǎng)容器

訂貨信息：

開放式培養(yǎng)瓶-用于CAR-T細(xì)胞優(yōu)化培養(yǎng)條件及小規(guī)模擴(kuò)增

備注：終獲得的細(xì)胞數(shù)量與培養(yǎng)面積相關(guān)，培養(yǎng)面積相同的培養(yǎng)瓶，終獲得的細(xì)胞數(shù)量是類似的。

其他應(yīng)用,已經(jīng)證實在如下細(xì)胞培養(yǎng)中非常有效：

※ 免疫細(xì)胞培養(yǎng)（抗原特異性T細(xì)胞、EBV-CTL、TL、NK、Treg、HSC、LCL、K562等的研究和臨床生產(chǎn)）

※ 單克隆抗體和重組抗體生產(chǎn)（雜交瘤、CHO、293等)

※ 胰島運輸（多至4000IE/cm²)

初始培養(yǎng)條件推薦：

應(yīng)用文獻(xiàn)參考：

一、CAR-T(嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞）的制備

Molecular Therapy  vol.22 no.3,623-633 mar.2014

Knetics of Tumor Destruction by Chineric Antigen Receptor-modified T Ces(CAR-T細(xì)胞破壞腫瘤的動力學(xué)研究）

作者：Usanarat Anurathapan1,et al,Juan F Vera1

單位：1Center for Cell and Gene Therapy,Baylor Colege of Medicine,Texas Children's Hospital,and Houston

Methodist Hospital,Houston,Texas,USA.

摘要：

CAR-T細(xì)胞作為血液惡性腫瘤和實體腫瘤的治療手段的應(yīng)用越來越廣泛。然而，在輸入T細(xì)胞靶向單一腫瘤相關(guān)的抗原產(chǎn)品的壓力下會導(dǎo)致靶抗原調(diào)節(jié)，造成腫瘤免疫逃逸。為了防止這種現(xiàn)象的發(fā)生，我們研究了同時靶向兩種不同的抗原對腫痛細(xì)胞的影響。namely mucin 1和prostate stem ce兩種抗原在包括胰腺癌和前列腺癌在內(nèi)的多種實體腫瘤中表達(dá)。單獨使用時，任何一種腫瘤抗原和CAR-T細(xì)胞的結(jié)合都能殺死腫瘤細(xì)胞，但腫瘤的異質(zhì)性會導(dǎo)致免疫逃逸。我們結(jié)合了兩種抗原識別的方法來顯示更好的抗腫瘤效果，但這仍然不足以達(dá)到*緩解（CR）。為了了解腫瘤逃逸的機(jī)制，我們研究了T細(xì)胞殺傷的動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)腫瘤破壞的程度不僅取決于靶抗原的存在，還取決于靶抗原表達(dá)的強度。而這一特征可以通過epigenetic modulator上調(diào)靶標(biāo)的表達(dá)，和增強CAR-T細(xì)胞的殺傷力來改變。

簡要實驗方法：

T細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)：將表達(dá)CAR-MUC2或CAR-PSCA的逆轉(zhuǎn)錄病毒在24孔板中感染。CAR-T細(xì)胞的快速擴(kuò)增使用G-REX 100M培養(yǎng)瓶，直接加入1L含50U/ml IL-2的培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增。

實驗結(jié)果：

針對不同靶點的CAR-T細(xì)胞治療效果：由于腫瘤存在異質(zhì)性，針對單一靶點會產(chǎn)生腫瘤免疫逃逸。而結(jié)合了兩種抗原識別的CAR-T細(xì)胞，擁有更強的抗腫瘤活性

摘要：

An Opimzed frocess of Generating CAR-T Cells for Cinical Applications

Pradip Bajgain1,et al,Juan F.Vera 1.

使用G-Rax100M擴(kuò)端CAR-PSCA T細(xì)胞，初給細(xì)胞數(shù)25E+6，一次性加入1L培養(yǎng)基，每周加入3次IL2，終得到細(xì)胞數(shù)2963.8±195.2E+6。

使用G-Rex生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞與傳統(tǒng)方法培養(yǎng)20天相比表達(dá)CD62L和CD25的比例更高，抗腫瘤活性更強。

二、TCR-T細(xì)胞的制備

JTransl Med (2018) 16:13

Erhanced ctinical-scale manutactuing of TCR rnsduced T-cels using closed cuture systen modues(使用封閉式系統(tǒng)加速臨床級別TCR-T細(xì)胞的生產(chǎn))

作者：Jianjan Jin1,et al,David F.Stroncek1 and Steven L.Highfl

單位：1Center or Celular Engineering. Departnment of Tanstuslon Medcne, Cintcal Center,Natonal hstutes of

Health,USA

摘要：

背景：用于表達(dá)特異性T細(xì)胞受體（TCR）的T細(xì)胞的基因工程已經(jīng)成為治療各種惡性腫瘤的新策略。由于缺乏能夠擴(kuò)增足夠數(shù)量的T細(xì)胞用于臨床的封閉培養(yǎng)系統(tǒng)，使得這些類型的療法的廣泛使用受到一定程度的限制。在這里，我們評估了一個強大的臨床級制造TCR基因工程工細(xì)胞的過程。

方法：對人乳頭瘤病毒E6和E7的TCR進(jìn)行了獨立測試。21天的過程分為一個轉(zhuǎn)導(dǎo)期（7天）和一個快速擴(kuò)增期（14天）。用兩份健康的供體樣本和四份上皮癌患者的樣本對這一過程進(jìn)行了評估。

結(jié)果：該過程使活的有核細(xì)胞增加了2000倍，并且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高（64%-92%）。在培養(yǎng)結(jié)束時，功能測定表明這些細(xì)胞有效而特異的殺傷腫瘤組胞的能力，并分泌大量的干擾素和腫瘤壞死因子。培養(yǎng)的兩個階段采用了封閉或半封閉的模塊，包括一階段的自動密度梯度分離和細(xì)胞培養(yǎng)袋以及第二階段的封閉的G-Rex培養(yǎng)裝置和洗滌/濃縮系統(tǒng)。

結(jié)論：使用模塊化系統(tǒng)和半自動設(shè)備，可以大規(guī)模的制造高活性的臨床級TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞。該過程目前正在NIH臨床中心和一些進(jìn)行中的臨床試驗中使用，并可用于其他使用封閉系統(tǒng)擴(kuò)大和優(yōu)化其生產(chǎn)過程的細(xì)胞治療制造場所。

生產(chǎn)流程圖。

此圖概括了E6 TCR-和E7 TCR-特異性T細(xì)胞的制造方案。一階段（左）概述了培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)導(dǎo)階段，并延續(xù)至第7天。在培養(yǎng)階段結(jié)束時，細(xì)胞可以冷凍保存，或者進(jìn)入第二階段（培養(yǎng)物的快速擴(kuò)增階段）。在這一階段，TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞與來自三個不同供體的同種異體飼養(yǎng)細(xì)胞混合，并在封閉的G-REX500培養(yǎng)裝置中擴(kuò)增14天。

三、TIL(腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞）的制備

JImmunother.2012 April:35(3):283-292

Simplified Method ol tho Growth of Human Tumor Infilrating Lymphootes (TIL)in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Pationt Treatment(使用透氣型培養(yǎng)瓶將TIL細(xì)胞培養(yǎng)至病人治療所需細(xì)胞數(shù)的筒單方法)

作者：Jianjian Jin1,et al,Steven A. Rosonberg2

單位:1Cell Processing Section,Department of Transfuslon Medicine,Clinical Center,National Institutes of

Heatth Bothesda,Maryland,USA 2Surgery Branch,Natonal Cancer Instituto,National Institutos of Heath,Bothesda,

Maryland,USA 3Wlson Wolf Manutacturing.New Bnghton,MN,USA

摘要：使用自體腫瘤浸潤腫瘤T淋巴細(xì)胞治療惡性黑色素瘤的臨床效果很好。但TIL細(xì)胞的制備過程非常困難。在此，我們使用一種透氣型培養(yǎng)瓶建立了快速擴(kuò)增TIL細(xì)胞的簡單方法。首先在G-Rex10中培養(yǎng)從腫瘤消化液和腫瘤碎片得到的TIL細(xì)胞，接下來使用能容納500ml培養(yǎng)基的G-REX100進(jìn)行快速的擴(kuò)增培養(yǎng)。來源于14位患者中13個的腫瘤消化液和全部11個腫痛碎片的TIL細(xì)胞，在G-Rex10中成功完成了初始生長。然后將得到的TIL細(xì)胞接種5×10⁶TIL到G-Rex100中，生長7天后分至3個G-Rex100。經(jīng)過2次快速擴(kuò)增，細(xì)胞可擴(kuò)增成8-10×10⁹，先將的TIL接種燒瓶中，為了獲得用于患者治療的30-60×10⁹組胞，我們用接種6只G-Rex100（5x10⁶細(xì)胞/瓶），擴(kuò)增成18個G-Rex100。用G-REX大規(guī)模培養(yǎng)TIL細(xì)胞，快速擴(kuò)增大約需要9-10升培養(yǎng)基，大約只有其做方法的1/3-1/4。

流程簡介：

TIL的初始培養(yǎng)：將病人的腫瘤組織切成小塊(1-8mm)，加入酶消化(RPMI 1640.2mM Glutmax.10 u g/mL慶大霉素30 units/mL. Dnase和1.0 mg/mL膠原酶），同時使用機(jī)械法進(jìn)行組織分離。組織塊加入消化液后立即機(jī)械分離1分鐘、然后放入孵箱孵育30分鐘，再次機(jī)械分離1分鐘。再放入孵箱繼續(xù)孵育30分鐘，然后進(jìn)行第三次機(jī)械分離。如果第三次分離之后仍有大塊組織存在，可以再進(jìn)行1-2輪處理。如果終產(chǎn)物中有大量紅細(xì)胞或死細(xì)跑，可進(jìn)行密度梯度離心去除。

分離得到的細(xì)胞取10-40×10⁶細(xì)胞加入40ml培養(yǎng)基，加入G-REX10培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。24孔板與G-REX10都放入孵箱，第2-3天換半液，培養(yǎng)至第五天。然后組胞轉(zhuǎn)至G-REX100。

TIL的快速擴(kuò)端培養(yǎng):

實驗結(jié)論：總體來說，與24孔板加普通培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)袋的流程相比，用透氣型G-REX培養(yǎng)瓶進(jìn)行TIL的起始培養(yǎng)與后續(xù)快速擴(kuò)增，需要的耗材更少，需要的培養(yǎng)基更少，需要的培養(yǎng)箱空間更少，需要的操作更少。使用G-REX培養(yǎng)瓶，將使大多數(shù)實驗室能大批量培養(yǎng)TIL用于臨床治療。

四、CTL(抗原特異性T淋巴細(xì)胞）的制備過程

JImmunother.2010 April:33(3):305-315

Accelerated production of antigen-specic T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-

permeable Rapid Expansion culture ware(G-Rex)(使用G-REX加速抗原特異性T細(xì)胞的生產(chǎn)過程以進(jìn)行臨床前和臨床應(yīng)用）

作者：Juan F.Vera,et. al.

單位：Center for Cell and Gene Therapy,Departments of Pediatrics,Immunology,Medicine,Virology,Baylor

College of Medicine,The Methodist Hospital and Texas Children's Hospital

摘要：用于過繼免疫治療的抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的大量制備，由于受到其預(yù)期功能和特異性的限制是非常復(fù)雜和花費時間的。其培養(yǎng)的條件非?？量蹋袝r只能在2cm²的孔中實現(xiàn)培養(yǎng)，但會受到氣體交換、營養(yǎng)物質(zhì)和廢物積累的限制。為克服這些困難而采用的一些生物反應(yīng)器復(fù)雜而昂貴，并且有時細(xì)跑生長的效果不佳。本研究發(fā)現(xiàn)抗原特異性CTL在經(jīng)過刺激后會經(jīng)歷7-10次分裂。但是預(yù)期的CTL擴(kuò)增倍數(shù)只有在培養(yǎng)的一周能達(dá)到。通過重復(fù)一周時的培養(yǎng)條件，我們能夠讓CTL細(xì)胞擴(kuò)增至預(yù)期的水平，這一水平能維持?jǐn)?shù)周而不影響細(xì)胞表型和功能。但是所需24孔板的數(shù)量非常多，并且需要頻繁的更換培養(yǎng)基，從而增加了實驗的復(fù)雜性和生產(chǎn)成本。因此，本研究評估了一種新型的適氣型培養(yǎng)裝置（G-REX)，該裝置通過底部的硅膠膜通透空氣，使得細(xì)胞生長不受培養(yǎng)基深度的限制。

實驗方法及結(jié)果：

實驗結(jié)論：G-Rex系統(tǒng)能夠有效的支持CTL細(xì)胞的擴(kuò)增，終可以增加高達(dá)20倍的產(chǎn)量，但所需的技術(shù)人員的時間卻大大下降。重要的是，在此裝置中的細(xì)胞擴(kuò)增不是因為細(xì)胞分裂的多，而是因為細(xì)胞死的少。因此這一裝置能增加T細(xì)胞產(chǎn)量，降低CTL生產(chǎn)時的復(fù)雜性和費用?？梢允辜?xì)胞療法更易接受。

五、NK（自然殺傷細(xì)胞）的制備

Cytotherapy,2012;14:1131-1143

Large-scale ex viwo expansion and characterization of natural killer cells- for clinical applications(大批量體外擴(kuò)增和鑒定NK細(xì)胞用于臨床治療)

作者：Natalia Lapteva1,et al.

單位：1Center for Cell and Gene Therapy.The Methodist Hospital,Texas Children's Hospital,Houston,TX and

2Department of Pediatrics,Baylor Colege of Medicine,Houston,Texas,USA,3National University of Singapore,

Singapore,and 4University of Arkansas Medical Center,Litle Rock,Arkansas,USA

摘要：

背景及目的：純化和大批量擴(kuò)增臨床級別細(xì)胞的新方法使以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫療法又引起人們的興趣。

方法：我們成功的將之前發(fā)表的，使用表達(dá)1L-15和4-1BBL的K562細(xì)胞擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，用新型的透氣型靜止培養(yǎng)瓶（G-REX）進(jìn)行了改進(jìn)。

結(jié)果：使用這一新的系統(tǒng)，我們從15×10⁷個CD3-CD56+NK細(xì)胞開始，在8-10天時間內(nèi)，制備了高達(dá)19×10⁹具備功能的NK細(xì)胞。G-REX與傳統(tǒng)透氣袋相比，擴(kuò)增NK細(xì)胞的倍數(shù)更高，培養(yǎng)過程中不需換液或操作細(xì)胞。我們也發(fā)現(xiàn)在NK細(xì)胞上清刺激的情況下，K562-mb15-41BBL細(xì)胞能上調(diào)了細(xì)胞表面HLA1|型抗原的表達(dá)，這一細(xì)胞能刺激NK細(xì)胞中自體反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞。但是這些CD3+T經(jīng)胞使用CliniMACS系統(tǒng)成功去除。我們優(yōu)化的NK細(xì)胞凍存方法使NK細(xì)胞凍存12個月后依然有活力和功能。

結(jié)論：我們成功建立了使用透氣型G-REX靜止培養(yǎng)并大量擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，符合GMP標(biāo)準(zhǔn)。這一方法能用于制備NK細(xì)胞進(jìn)行癌癥免疫治療。

優(yōu)點：

※ 同樣培養(yǎng)時間，細(xì)胞增殖更快

※ 每個G-REX一次性加入400ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中無需換液，無需再續(xù)培養(yǎng)基

※ 操作少，減少污染的風(fēng)險

※ 靜置培養(yǎng)，在普通的培養(yǎng)箱放置即可

※ 細(xì)胞回收時可以先棄去大部分培養(yǎng)基再離心（1000ml vs.8000ml），操作更簡單。