紅外顯微光譜法是非破壞性、結(jié)構(gòu)敏感的檢測方法，目前已在基于分子結(jié)構(gòu)的單細(xì)胞領(lǐng)域的研究中發(fā)揮重大作用，諸如蛋白構(gòu)象改變、氧化還原、脂質(zhì)體的產(chǎn)生與降解等。但是受制于紅外光譜儀本身的限制，對于生物組織樣品來說制樣非常困難，因此極大的限制了紅外光譜在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。

O-PTIR (Optical Photothermal Infrared) 光學(xué)光熱紅外光譜是一種快速簡單的非接觸式光學(xué)技術(shù)，通過檢測由于本征紅外吸收引發(fā)的樣品表面快速的光熱膨脹或收縮，克服了傳統(tǒng)IR衍射的極限，空間分辨率可達(dá)500 nm。

近期，美國PSC公司又推出了非接觸亞微米分辨熒光紅外拉曼同步測量系統(tǒng)mIRage-LS，將O-PTIR技術(shù)與熒光（FL）進(jìn)一步有機(jī)結(jié)合，利用落射熒光快速定位 O-PTIR 測量的區(qū)域，提供了對樣品熒光標(biāo)記區(qū)域以及鄰近未標(biāo)記組織的化學(xué)結(jié)構(gòu)的快速光譜分析。

圖 1. FL-OPTIR 顯微鏡基本原理和觀測方法

這項(xiàng)全新的技術(shù)對樣品要求非常低，而紅外光譜的空間分辨率可達(dá)亞微米級別，為紅外光譜在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用提供了全新的視角。比如在阿爾茨海默病 (AD) 研究方面，AD的關(guān)鍵病理特征是淀粉樣蛋白折疊，這些 β-折疊結(jié)構(gòu)具有特定的振動特征，對于紅外光譜來說十分敏感，但是受制于傳統(tǒng)紅外光譜儀本身的限制，在生物組織樣品上直接測量非常困難。而非接觸式的FL-PTIR技術(shù)卻能夠很好適用于這些樣品，并且已經(jīng)有多個小組通過實(shí)驗(yàn)證明了FL-PTIR能夠應(yīng)用于具有特殊化學(xué)敏感性的活細(xì)胞成像研究。

Craig Prater等人通過這項(xiàng)技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了熒光定位下的OPTIR紅外觀測，并且完成了對組織中單個病理結(jié)構(gòu)內(nèi)的 β-折疊結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、在腦組織的特定細(xì)胞和培養(yǎng)的原代神經(jīng)元分析。首先，作者使用了12個月周齡的 APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦切片，用淀粉樣蛋白特異性發(fā)光共軛聚電解質(zhì)探針mytracker R（Ebba Biotech，Solna，Sweden）進(jìn)行標(biāo)記，并用OPTIR進(jìn)行觀測β 折疊結(jié)構(gòu)的分布。相比于傳統(tǒng)紅外很難定位的問題，F(xiàn)L-OPTIR通過寬場熒光能夠快速定位淀粉樣蛋白斑塊。并直接在腦組織中評估其在單個斑塊中的結(jié)構(gòu)。通過 k 均值聚類方法對其進(jìn)行分析，清楚地顯示了在 1630 cm^–1處具有高振幅和低振幅的兩組光譜的存在，并且具有 1630 cm^–1高振幅的光譜清楚地與熒光信號共定位。光譜分析表明 Amytracker 沒有對酰胺 I 和 II 區(qū)域有明顯的吸收，因此表明 Amytracker 可用于 OPTIR 測量的熒光引導(dǎo)。

圖 2. FL-OPTIR 對腦組織中的淀粉樣斑塊進(jìn)行成像熒光和紅外圖譜和熱圖的展示。

在第二個實(shí)驗(yàn)中，作者提供了一個概念性方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明 FL-OPTIR 可用于研究組織中的特定細(xì)胞類型，而這對傳統(tǒng)紅外顯微光譜法來說十分具有挑戰(zhàn)性。為此作者對腦組織中與淀粉樣斑塊相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行成像，以評估它們的光譜特征，從而了解小膠質(zhì)細(xì)胞是否可以將 Aβ 原纖維轉(zhuǎn)化為單體的問題。這個實(shí)驗(yàn)使用 Aβ 特異性抗體 82E1 標(biāo)記的 16 μm 組織切片，并用抗體 Iba1 對小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了免疫標(biāo)記。通過FL-OPTIR可以定位淀粉樣斑塊附近的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并測量 OPTIR 光譜。通過測量，發(fā)現(xiàn) 82E1 陽性小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出β-折疊含量升高，表明小膠質(zhì)細(xì)胞與 Aβ 原纖維相關(guān)。

圖 3. 腦組織中淀粉樣斑塊周圍小膠質(zhì)細(xì)胞的成像。

在第三個實(shí)驗(yàn)中，作者研究了 FL-OPTIR 在培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中 Aβ結(jié)構(gòu)成像的適用性。與組織研究類似，淀粉樣蛋白的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性使得研究神經(jīng)毒性與 Aβ 結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系仍具有挑戰(zhàn)性。因此，為了直接評估神經(jīng)元中的淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)，作者使用FL-OPTIR技術(shù)基于熒光信號引導(dǎo)的光譜測量，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端比近端神經(jīng)突部分（分支后）相關(guān)的 Aβ 包含更多的 Aβ-聚集體, 作者認(rèn)為這些神經(jīng)元隔室可能本質(zhì)上更容易結(jié)合 Aβ或者能夠主動運(yùn)輸?shù)竭h(yuǎn)端。

圖 4. 初級神經(jīng)元中 Aβ (1–42) 的結(jié)構(gòu)成像。

總結(jié)：

新型成像方法FL-OPTIR 結(jié)合了熒光成像和紅外光譜來描述生物組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化。能夠針對復(fù)雜系統(tǒng)中的特定細(xì)胞、細(xì)胞器和分子進(jìn)行分析和檢測，解決了生物標(biāo)本中紅外光譜定位困難的問題。能夠直接在組織中定位和分析淀粉樣蛋白和相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞，這可以解決局部環(huán)境在 AD 進(jìn)展中的作用，幫助識別與淀粉樣斑塊相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞，并在亞細(xì)胞水平上直接研究小膠質(zhì)細(xì)胞中的纖維結(jié)構(gòu)。為復(fù)雜樣品中的蛋白質(zhì)和細(xì)胞進(jìn)行紅外光譜分析提供了新的測量方法，為紅外在生物領(lǐng)域的應(yīng)用提供更加便捷實(shí)驗(yàn)途徑。

作為美國PSC公司在中國的代理，Quantum Design中國于2020年將非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)—mIRage系統(tǒng)引入國內(nèi)，助力中國科研工作者取得一個又一個重大突破：

國內(nèi)經(jīng)典案例分享：

南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院借助mIRage建立了一種新型的塑料表面亞微米尺度化學(xué)變化表征方法。該工作發(fā)表在期刊Nature Nanotechnology上。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)借助mIRage成功實(shí)現(xiàn)對玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征。該工作發(fā)表在Science of the Total Environment上。

為滿足國內(nèi)日益增長的生物紅外表征需求，更好的為國內(nèi)科研工作者提供專業(yè)技術(shù)支持和服務(wù)，Quantum Design中國北京樣機(jī)實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了熒光引導(dǎo)光學(xué)光熱紅外顯微光譜，為您提供樣品測試、樣機(jī)體驗(yàn)等機(jī)會，期待與您的合作！ 

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