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技術(shù)文章

抗體捕捉生物測定法檢測IL—12

閱讀:473          發(fā)布時間:2012-5-5

IL-12由B細(xì)胞產(chǎn)生,由分子量分別為35kD和40kD兩個亞基通過二硫鍵連接而成,其功能為誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-7;增強T細(xì)胞、NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,促進激活的T細(xì)胞、NK細(xì)胞增殖。
利用鼠抗人IL-12McAb(可自Roche公司購得)測IL-12濃度。
1.用包被緩沖液(pH9.5的碳酸鈉緩沖液)稀釋包被抗體為15ug/mL,在96孔酶標(biāo)反應(yīng)板,每孔加100rtl,室溫包被過夜。
2.洗滌后加封閉液(含1%BSA的磷酸鹽緩沖液)每孑L 2001uL,37℃1h。
3.在試管中稀釋IL-12標(biāo)準(zhǔn)品為1ng/mL,然后作5倍系列稀釋至8pe/mL(3管)。
4.待測樣品用*培養(yǎng)液作5倍系列稀釋3—5個稀釋度。
5.酶標(biāo)板洗滌后,分別加各稀釋度Ibl2標(biāo)準(zhǔn)品及待檢標(biāo)本,每孔100uL,每一標(biāo)本設(shè)3復(fù)孔,加100~L*培養(yǎng)液,室溫孵育2.5—3ho
6.洗5次后,加PHA激活的人淋巴母細(xì)胞懸液(終濃度為2X104/mL)100uL/孔,C02溫箱培養(yǎng)24h。
7.加3H-TdR,以下步驟同IL-2測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-12水平。
8.注意事項 應(yīng)盡量使待測樣品孔的3H-TdR摻人率位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的陡峭部分,這樣所得結(jié)果才準(zhǔn)確。此外,由于IL-12分泌細(xì)胞中有40kD多肽的過量表達,而40kD多肽無IL-12的生物活性,故并非所有的抗IL-12抗體均適用于本法。
 

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