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技術(shù)文章

轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)的測定

閱讀:1553          發(fā)布時間:2011-12-17

轉(zhuǎn)化生長因子α(transforming growth factor-α,TGF-α)的結(jié)構(gòu)和功能與TGF相似,屬EGF家族。檢測EGF生物學(xué)活性的方法也可以檢測TGF-α的活性。此外,EGF能誘導(dǎo)3T3小鼠的J2細(xì)胞合成DNA,TGF-α與EGF競爭受體,抑制EGF的作用,故可通過抑制EGF誘導(dǎo)的DNA合成試驗檢測TGF-α的活性。

 
    1.將3T3J2細(xì)胞培養(yǎng)在含0.5%FCS的DMEM培養(yǎng)液中,用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次,并配成6×104/mL。
 
    2.于24孔培養(yǎng)板每孔加入0.5mL細(xì)胞懸液,用細(xì)胞培養(yǎng)液作系列稀釋的TGF-a待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)晶0.5mL、1nmol/LEGF和luCi(37kBp)3H-TdR,并設(shè)置單加EGF的陽性對照和高劑量TGF-a陰性對照,均設(shè)3復(fù)孔,總反應(yīng)體積為lmL。
 
    3.置37~C 5%C02溫箱中培養(yǎng)72h。用PBS洗3次,每孔加入5%三氯醋酸lmL沉淀DNA,再用甲醇洗孔1次,離心去甲醇溶液。加入lmLlmol/LNaOH,溶解細(xì)胞。將各孔細(xì)胞吸人閃爍液瓶中,在p-計數(shù)儀上測定各孔的cpm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中的TGF-a含量(活性)。

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