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多聚甲醛固定美麗線蟲體法
閱讀：924 發(fā)布時(shí)間：2011-3-24 蟲體的第二種常用的固定方法是使用多聚甲醛。此法比上述的Bouin固定法溫和，但通常需要使用膠原酶。這種方法尤其適用于檢測(cè)成蟲。
1．所需的溶液和試劑
4％多聚甲醛（新鮮配制，見附錄Ⅳ）；
含1％NP—40， 200mmol／L二硫基蘇糖醇（DTT）的20mm01／L硼酸鈉（pH9．6）；
含1％NP一40的PBS；
含50％甲醇，20mmol／LEDTA， 10mmol／L亞精胺鹽酸的PBS。
2．操作步驟
（1）用含0．05％NP—40的PBS（4℃）洗平皿的表面，以去除幼蟲的生長介質(zhì)。將全部液體轉(zhuǎn)入一支15m1錐形管中。
（2）以200g離心1min。去除上清。將蟲體轉(zhuǎn)至另一1．5m1錐形管中，加入lml含0．05％NP一40的PBS（4℃）。
在固定液中的時(shí)間長短可影響不同抗原抗體結(jié)合的能力。根據(jù)所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)應(yīng)經(jīng)過預(yù)試建立一個(gè)
*的固定時(shí)間。
（3）以200g離心10s。盡可能將上清*去除。
（4）加50／ll含50％甲醇、20mmol／LEGTA和10mmol／L亞精胺鹽酸的PBS， 以及500／1l 4％多聚甲醛（新鮮配制，見附錄Ⅳ）。將此管浸入液氮中快速冷凍。取出后在流動(dòng)的溫水中使其融化。隨后再浸入液氮中。如上述一樣在流動(dòng)的溫水中融化。
固定的蟲體從液氮取出后，在—70℃可以至少保存一年。
（5）在4℃孵育1～24h。
（6）用含0．05％NP—40的PBS（4℃）洗滌蟲體2次。
（7）離心，并去除zui后的洗液。重懸于含1％NP-40，100mmol／L DIT的20mm01／L硼酸鈉（pH9．6）中。在室溫下孵育2ho
如果使用*階段幼蟲的樣本，在孵育過程中還需要多凍融（同步驟4）2次，以增強(qiáng)透化處理。
（8）用含0．05％NP一40的PBS（4℃）洗3次。
（9）在含0．3％過氧化氫的20mmol／L硼酸鈉（pH9．6） （新鮮配制）中孵育15min。
（10）用含0．05％NP—40的PBS（4℃）洗3次。
至此，樣品可以加入抗體進(jìn)行染色。