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鹽析法分離與純化蛋白質(zhì)注意
閱讀：2345 發(fā)布時(shí)間：2011-1-6 1）鹽的飽和度：鹽的飽和度是影響蛋白質(zhì)鹽析的重要因素，不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。分離幾個(gè)混合組分的蛋白質(zhì)時(shí)，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加，每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行離心或過(guò)濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀。例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質(zhì)，飽和度達(dá)20%時(shí)，纖維蛋白原首先析出；飽和度增至28%～33%時(shí)，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至33%～50%時(shí)，擬球蛋白析出；飽和度大于50%以上時(shí)，白蛋白析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，從牛胰中酸性提取分離可得到九種以上蛋白質(zhì)及酶。
2）pH值：在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度zui小容易沉淀析出，因此，鹽析時(shí)除個(gè)別情況外，pH值常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。
3）蛋白質(zhì)濃度：在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀，使用鹽的飽和度的極限愈低，如血清球蛋白的溶度從0.5%增到3.0%時(shí)，需用中性鹽的飽和度的zui低極限從29%遞減至24%。某一蛋白質(zhì)欲進(jìn)行兩次鹽析時(shí)，第1次由于濃度較稀，鹽析分段范圍較寬，第2次則逐漸收窄，例如用硫酸銨鹽析膽堿酯酶時(shí)，第1次硫酸銨飽和度為35%至60%，第2次為40%至60%。蛋白質(zhì)濃度高些雖然對(duì)沉淀有利，但濃度過(guò)高也容易引起其他雜蛋白的共沉作用，因此，必須選擇適當(dāng)濃度，盡可能避免共沉作用的干擾。
表2-2 0℃下由S1提高到S2時(shí)每100ml加固體硫酸銨的克數(shù)
溶液的原始飽和度（%） 飽和度 在0℃時(shí)所達(dá)到硫酸銨飽和度（%）
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
在100毫升中欲加固體硫酸銨的克數(shù)
0 10.6 13.4 16.4 19.4 22.6 25.8 29.1 32.6 36.1 39.8 43.6 47.6 51.6 55.9 60.3 65.0 69.7
5 7.9 10.8 13.7 16.6 19.7 22.9 26.2 29.6 33.1 36.8 40.5 44.4 48.4 52.6 57.0 61.5 66.2
10 5.3 8.1 10.9 13.9 16.9 20.0 23.3 26.6 30.1 33.7 37.4 41.2 45.2 49.3 53.6 58.1 62.7
15 2.6 5.4 6.2 11.1 14.1 17.2 20.4 23.7 27.1 30.6 34.3 38.1 42.0 46.0 50.3 54.7 59.2
20 0 2.7 5.5 8.3 11.3 14.3 17.5 20.7 24.1 27.6 31.2 34.9 38.7 42.7 46.9 51.2 55.7
25 0 2.7 5.6 8.4 11.5 14.6 17.9 21.1 24.5 28.0 31.7 35.5 39.5 43.6 47.8 52.2
30 0 2.8 5.6 8.6 11.7 14.8 18.1 21.4 24.9 28.5 32.3 36.2 40.2 44.5 48.8
35 0 2.8 5.7 8.7 11.8 15.1 18.4 21.8 25.4 29.1 32.9 36.9 41.0 45.3
40 0 2.9 5.8 8.9 12.0 15.3 18.7 22.2 25.8 29.6 33.5 37.6 41.8
45 0 2.9 5.9 9.0 12.3 15.6 19.0 22.6 26.3 30.2 34.2 38.3
50 0 3.0 6.0 9.2 12.5 15.9 19.4 23.0 26.8 30.8 34.8
55 0 3.0 6.1 9.3 12.7 16.1 19.1 23.5 27.3 31.3
60 0 3.1 6.2 9.5 12.9 16.4 20.1 23.9 27.9
65 0 3.1 6.3 9.7 13.2 16.8 20.5 21.4
70 0 3.2 6.5 9.9 13.4 17.1 20.9
75 0 3.2 6.6 10.1 13.7 17.4
80 0 3.3 6.7 10.3 13.9
85 0 3.4 6.8 10.5
90 0 3.4 7.0
95 0 3.5
100 0
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
在100毫升中欲加固體硫酸銨的克數(shù)
0 10.6 13.4 16.4 19.4 22.6 25.8 29.1 32.6 36.1 39.8 43.6 47.6 51.6 55.9 60.3 65.0 69.7
5 7.9 10.8 13.7 16.6 19.7 22.9 26.2 29.6 33.1 36.8 40.5 44.4 48.4 52.6 57.0 61.5 66.2
10 5.3 8.1 10.9 13.9 16.9 20.0 23.3 26.6 30.1 33.7 37.4 41.2 45.2 49.3 53.6 58.1 62.7
15 2.6 5.4 6.2 11.1 14.1 17.2 20.4 23.7 27.1 30.6 34.3 38.1 42.0 46.0 50.3 54.7 59.2
20 0 2.7 5.5 8.3 11.3 14.3 17.5 20.7 24.1 27.6 31.2 34.9 38.7 42.7 46.9 51.2 55.7
25 0 2.7 5.6 8.4 11.5 14.6 17.9 21.1 24.5 28.0 31.7 35.5 39.5 43.6 47.8 52.2
30 0 2.8 5.6 8.6 11.7 14.8 18.1 21.4 24.9 28.5 32.3 36.2 40.2 44.5 48.8
35 0 2.8 5.7 8.7 11.8 15.1 18.4 21.8 25.4 29.1 32.9 36.9 41.0 45.3
40 0 2.9 5.8 8.9 12.0 15.3 18.7 22.2 25.8 29.6 33.5 37.6 41.8
45 0 2.9 5.9 9.0 12.3 15.6 19.0 22.6 26.3 30.2 34.2 38.3
50 0 3.0 6.0 9.2 12.5 15.9 19.4 23.0 26.8 30.8 34.8
55 0 3.0 6.1 9.3 12.7 16.1 19.1 23.5 27.3 31.3
60 0 3.1 6.2 9.5 12.9 16.4 20.1 23.9 27.9
65 0 3.1 6.3 9.7 13.2 16.8 20.5 21.4
70 0 3.2 6.5 9.9 13.4 17.1 20.9
75 0 3.2 6.6 10.1 13.7 17.4
80 0 3.3 6.7 10.3 13.9
85 0 3.4 6.8 10.5
90 0 3.4 7.0
95 0 3.5
100 0
4）溫度：由于濃鹽液對(duì)蛋白質(zhì)有一定保護(hù)作用，鹽析操作一般可在室溫下進(jìn)行，至于某些對(duì)熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。雖然蛋白質(zhì)在鹽析時(shí)對(duì)溫度要求不太嚴(yán)格，但在中性鹽下結(jié)晶純化時(shí)，溫度影響則比較明顯。
5）脫鹽：蛋白質(zhì)、酶用鹽析法沉淀分離后，常需脫鹽才能獲得純品。zui常用的脫鹽方法是透析法，如圖2-1所示：把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，袋的二端用線(xiàn)扎緊，然后用蒸餾水或緩沖液進(jìn)行透析，這時(shí)鹽離子通過(guò)透析袋擴(kuò)散到水或緩沖液中，蛋白質(zhì)分子量大不能穿透析袋而保留在袋內(nèi)，通過(guò)不斷更換蒸餾水或緩沖液，直至袋內(nèi)鹽分透析完畢。透析需要較長(zhǎng)時(shí)間，常在低溫下進(jìn)行，并加入防腐劑避免蛋白質(zhì)和酶的變性或微生物的污染。
此外用葡聚糖凝膠脫鹽的效果也很好，其原理和應(yīng)用方法在這里不贅述。