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制備用于抗原上選擇的噬菌體抗體
閱讀：806 發(fā)布時間：2010-11-29轉(zhuǎn)化后，就得到了菌苔形式的抗體文庫?？梢灾苽涑筛视蛢Υ嫖锉４嬗谝?0℃。這是一個原始文庫，象征著具有*價值的資源。的抗體文庫也是由這種原始文庫制備而來的。然而，當(dāng)用大培養(yǎng)板鋪板擴增原始文庫時，會造成部分多樣性的丟失。因此在任何噬菌體制備或細(xì)菌擴增步驟中，接種量必須總是大于5倍的文庫容量，從而保持文庫的多樣性。
在大多數(shù)噬菌體展示載體中，抗體片段的表達是由lacZ啟動子啟動的。盡管這個啟動子存在某些漏洞并可以優(yōu)化，但以以下一些指導(dǎo)進行操作，其效果依然良好。在噬菌體救援前，含有抗體文庫的細(xì)菌在葡萄糖存在的條件下，可生長至對數(shù)期。葡萄糖可抑制lacZ啟動子的活性，因此使pⅢ和抗體表達都下降。這就有兩點重要作用：一是由于pⅢ和抗體產(chǎn)生的毒性下降，防止了文庫的偏性發(fā)生；二是抑制了pⅢ表達就可允許細(xì)菌纖毛表達，從而使輔助噬菌體能進行感染。如果沒有葡萄糖，感染效率會急劇下降，結(jié)果大大降低了抗體文庫的有效容量：輔助噬菌體感染后，則須去除葡萄糖，以便讓pⅢ和抗體進行表達。而后，低水平lacZ啟動子驅(qū)動pⅢ表達，但這已足以進行有效的展示了。用異丙基硫代半乳糖苷（1PTG）誘導(dǎo)啟動子達不到預(yù)期效果，反而大大降低了展示水平。這是由pⅢ和抗體融合蛋白的毒性及pⅢ抗體融合蛋白的降解所致。對于scFv文庫和Fab文庫，過夜生長階段的典型溫度是30℃；此溫度下，抗體展示水平似乎更佳。選擇前，先用PEG沉淀法從培養(yǎng)基上清中制備噬菌體。這樣就可以去除不*抑制或蛋白水解切除所產(chǎn)生的抗體片段。這些抗體片段能與噬菌體競爭結(jié)合。PEG沉淀也可以去除其他任何能干擾選擇的污染物。如果計劃長期保存噬菌體，推薦接著進行氯化銫離心純化。
自抗體文庫儲存料中制備噬菌體。在開始實驗之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀釋鋪板）計算每毫升抗體文庫儲存料中細(xì)菌的數(shù)目。在600nm（A600）處的某個特定吸光值下，抗體文庫中細(xì)菌數(shù)目較未感染細(xì)菌數(shù)目低一些。這或許是因為含有質(zhì)粒的文庫細(xì)菌體積更大，或者是存在死細(xì)菌。一旦滴度與A600確定關(guān)系，吸光值即可用于細(xì)菌數(shù)目的計算。對于噬菌體的制備（文庫救援），來自文庫儲存料的起始接種量應(yīng)比文庫容量大5倍。接種到培養(yǎng)基后，細(xì)菌濃度的A600不應(yīng)超過0．05。采用文庫容量5倍以上的細(xì)菌接種以確保它能呈現(xiàn)出文庫中的所有成員。而培養(yǎng)起始的A600小于0．05，則可以確保輔助噬菌體加入前處于多倍增長期，以提高輔助噬菌體感染的有效性。用于救援的zui小培養(yǎng)體積必須根據(jù)文庫容量和0．05的zui大起始A600值來確定。例如，含有1．0×l010個成員的抗體文庫所需要的起始接種量為5．0×l0l0個細(xì)菌。因為1．0A600＝1．0×109，為保證起始培養(yǎng)液A600值小于0．05，則需要1L的培養(yǎng)體積。此體積的培養(yǎng)液應(yīng)平均分到兩個含有250ml 2×TY/amp/glu培養(yǎng)基的2L錐形瓶中。葡萄糖會抑制pⅢ的表達，但允許纖毛的表達。
使用新鮮制備的噬菌體才會得到*選擇結(jié)果。這是因為即便在-80℃下保存，展示抗體也會隨時間的推移而出現(xiàn)緩慢的蛋白水解。應(yīng)用氯化銫梯度離心法純化菌體，能顯著降低蛋白的水解。這樣純化后，蛋白質(zhì)會非常穩(wěn)定。預(yù)期產(chǎn)量是每毫升原始培養(yǎng)液產(chǎn)生（1～5）×101l個噬菌體，而氯化銫純化后產(chǎn)量會下降50％。