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技術(shù)文章

自文庫甘油儲存料中制備噬菌體抗體

閱讀:1633          發(fā)布時間:2010-11-29
 
[器材和試劑]
●  500ml無菌聚丙烯離心瓶
●  2L培養(yǎng)錐形瓶
●  RC5離心機(jī)和GS3轉(zhuǎn)頭(Sorvall)
●  2×TY/amp/glu培養(yǎng)基
●  TYE/amp/glu平板
●  含有25ug/ml卡那霉素和2%葡萄糖的TYE平板(TYE/kan/glu)
●  含100ug/ml氨芐青霉素和25ug/m1卡那霉素的2×TY培養(yǎng)基(2×TY/amp/kan)
●  輔助噬菌體(VCSMl3、R408或M13K  07  Stratagene、NEB或Amersham  Biosciences)
●  20%聚乙二醇(PEG)6000,2.5mol/L NaCl溶液
●  磷酸鹽緩沖液(PBS),pH 7.4
●  文庫甘油儲存料
 
[方法]
1.取適當(dāng)數(shù)量(參見上述討論)的甘油文庫儲存料接種到含有250m1 2×TY/amp/glu的  2L培養(yǎng)錐形瓶中。培養(yǎng)基的A600值應(yīng)小于0.05。從每個培養(yǎng)瓶中取1ul鋪板確定起始接種物的細(xì)菌量。
2.在37℃下振蕩(300r/min)培養(yǎng),直到As。。值為0.05(L 5~2.5h)
3.按照輔助噬菌體與細(xì)菌之比等于(10~20):1的比例加入輔助噬菌體。孵育培養(yǎng)液,37℃30分鐘,需水浴中直立放置并不時攪拌;而后,37℃振蕩培養(yǎng)30分鐘。
4.從每瓶中取lul并用1ml 2×TY稀釋;取1ul及10ul分別在TYE/amp/glu和TYE/ kan/glu平板上鋪板,以確定輔助噬菌體感染有效性。每個平板上的克隆數(shù)應(yīng)當(dāng)大致相同,  同時卡那霉素抗性克隆數(shù)應(yīng)大于氨芐青霉素抗性克隆數(shù)的10%。
5.將500ml瓶裝入GS3轉(zhuǎn)頭,以3000r/min離心細(xì)菌培養(yǎng)液。棄去上清。
6.將細(xì)菌沉淀重懸于2×TY/amp/kan中,并分裝到2L錐形瓶中;其中的培養(yǎng)液不應(yīng)超過250ml。在25~30℃下振蕩(300r/min)培養(yǎng)過夜。
7.用GS3轉(zhuǎn)頭及500ml瓶以10000r/min 30分鐘離心菌液。將上清部分轉(zhuǎn)移至1個新的500ml瓶內(nèi)。
8.將l/10~1/5體積的PEG溶液加入到上清中,冰上放置1小時。這會使噬菌體沉淀,此時上清中會呈現(xiàn)云霧狀。
9.用GS3轉(zhuǎn)頭及500m1瓶以4000r/min,4℃15分鐘離心沉淀噬菌體。棄去上清。再離心“干”沉淀30秒,  以甩掉zui后幾滴上清。去除液體。用1/10體積的PBS重懸沉淀。
10.以10000r/minl5分鐘離心沉淀細(xì)菌碎片,并將上清轉(zhuǎn)移至1個新瓶中。
11.重復(fù)步驟7-9以進(jìn)一步純化噬菌體,但zui終重懸液的體積應(yīng)當(dāng)是起始培養(yǎng)液體積的1/50。這樣制備的噬菌體可以立即用于選擇,否則需按每份1013個噬菌體等量分裝,保存于-80℃。

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