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技術(shù)文章
標記蛋白的概述
閱讀：2896 發(fā)布時間：2010-11-24從建立了克隆表達技術(shù)以來，將2個編碼區(qū)域融合構(gòu)建一個具有2個起始多肽特性的新蛋白， 已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中。下圖利用來源于c-myc蛋白表位結(jié)構(gòu)的詳細知識，構(gòu)建了一個可供商品化抗體識別的新蛋白。這種方法已經(jīng)成為分子克隆的主要技術(shù)，任何新識別的編碼區(qū)均可通過在多肽上加一個表位序列，即可被特異性抗體識別。亦可將其他感興趣的蛋白或功能區(qū)的編碼基因與研究中的抗原基因融合，如將所研究的蛋白質(zhì)編碼基因與谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶（GST）基因融合，并可在E．coli中合成一個可溶性蛋白，該蛋白可通過與谷胱甘肽珠結(jié)合得到純化。目前已有許多有價值的其他純化標記物得到了廣泛的應(yīng)用。新近GFP融合技術(shù)的應(yīng)用，更加豐富了這一領(lǐng)域的內(nèi)容，該技術(shù)通過使用非免疫的檢測方法對蛋白進行定位。這一技術(shù)的發(fā)展為蛋白標記物的應(yīng)用提供了新的方式。
采用DNA重組技術(shù)對蛋白進行標記，并可在不同的宿主細胞系統(tǒng)中對其進行純化和特異性檢測，包括為進行檢測（如綠色熒光蛋白標記物，GFP）或純化（如His標記物和谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶標記物）而設(shè)計的特異性標記物。目前已經(jīng)制備出與短肽序列（表位標記物）結(jié)合力較強且特異性高的抗體，標記蛋白已被廣泛應(yīng)用，并已建立了為蛋白的調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)和功能研究的新方法。
傳統(tǒng)的方法多以放射性同位素或熒光染料標記蛋白，標記過程中要求有純化的蛋白質(zhì)。通過DNA重組方法標記蛋白是一重大的技術(shù)發(fā)展，該方法在蛋白質(zhì)合成過程中將標記物（1abel或tag）直接連接到蛋白質(zhì)上。標記物本身是一個小的開放閱讀框，在研究中，采用分子生物學(xué)技術(shù)將其與目的蛋白融合。
DNA重組技術(shù)的先進性在于可在各種表達系統(tǒng)中制備和檢測標記蛋白，并可通過標記物對雜交蛋白進行檢測和純化。目的蛋白可與綠色熒光蛋白）或谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶蛋白（GSF）等標志物融合，或與一些短肽，如His標記物以及能夠與鏈霉親和素結(jié)合的標記物融合，其中短肽可與特定的配體結(jié)合。
肽標記的另一方法是表位標記，即將1個短的氨基酸序列插入到靶蛋白編碼區(qū)，其氨基酸序列可與已知的單克隆抗體或多克隆抗體結(jié)合，從而可采用各種免疫技術(shù)檢測和純化標記的靶蛋白，因已有商品化的特異性針對標記物的抗體。
DNA重組標記技術(shù)的成功是因為標記并不改變被標記蛋白的功能，特別有兩大進展使得標記技術(shù)切實可行：①通過合成寡核苷酸和PCR技術(shù)將標記物插入到蛋白表達載體中；②在病毒、細菌、植物、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞系統(tǒng)中可表達重組標記蛋白。應(yīng)用針對5～10個氨基酸線性表位的單克隆抗體對表位作圖，為實驗研究提供了大量標記物，從而可以同時對多種不同的標記蛋白活性進行分析。
標記的*步是獲得編碼蛋白質(zhì)的基因克隆和經(jīng)過測序的開放閱讀框，并具備分子生物學(xué)技術(shù)知識和工作經(jīng)驗，包括克隆、測序和PCR技術(shù)。這些方法在Sambrook等（1989）的著作中有詳細描述。
標記物一般用于兩個目的：①蛋白檢測：即標記物的引入使得能夠檢測細胞表達系統(tǒng)中的標記蛋白，從而可對蛋白的功能、蛋白質(zhì)在細胞的定位以及相互作用和生化活性進行研究；②蛋白純化：即選擇一種可以與某種固相化配體結(jié)合的標記物，從而可以從細胞抽提物中批量純化蛋白。