大鼠TNF αELISA檢測試劑盒
日本IBL進(jìn)口原裝   貨號(hào):27194  規(guī)格：96T
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前言簡介
腫瘤壞死因子α是分子量為17.5 kDa,由157個(gè)氨基酸組成的強(qiáng)效淋巴因子,在各種腫瘤細(xì)胞和靶細(xì)胞發(fā)揮著細(xì)胞毒素作用. 腫瘤壞死因子α在炎性前癥發(fā)揮關(guān)鍵作用,并能在患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的骨滑液中檢測到.它是免疫調(diào)節(jié)作用的初始調(diào)節(jié)者. 腫瘤壞死因子α的分泌是經(jīng)過嚴(yán)格控制的,由極小量的休眠細(xì)胞分泌,主要為激活細(xì)胞的分泌因子.
原理
此試劑盒運(yùn)用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強(qiáng)度與大鼠腫瘤壞死因子α的量成正比.
 
檢測范圍
56.25 ～3,600 pg/mL
 
預(yù)期用途
 
■此IBL試劑盒能用于大鼠細(xì)胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子α的定量檢測
■重組和天然的大鼠腫瘤壞死因子α都能檢測
 
試劑盒成分
1  預(yù)包被板:  抗大鼠腫瘤壞死因子α兔子IgG,親合純化             96T
2  酶標(biāo)記抗體:
 （30倍濃縮）HRP標(biāo)記抗大鼠腫瘤壞死因子α兔子IgG,親合純化      0.4mL x 1
3  標(biāo)準(zhǔn)品:      重組大鼠腫瘤壞死因子α                      1.0mL x 2     
4  EIA緩沖液:         含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                       30mL x 1
5  標(biāo)記抗體稀釋液:       含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                  12mL x 1
6  顯色劑:                                 TMB底物液                                                15mL x 1
7  終止液:                                     1N硫酸                                                   12mL x 1
8  濃縮洗滌液:
 （40倍濃縮） 含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                      50mL x 1
 
 
操作說明
1實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒沒有提供）
  酶標(biāo)儀（450nm）          微移液管及其槍頭
  量筒及燒杯             去離子水
  冰箱（4°C）               坐標(biāo)紙（log/log）
  吸水紙                 試管（用于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋）
  溫育箱（37°C ± 1°C）
  洗瓶（用于洗板）
  一次性試劑管（用于濃縮酶標(biāo)記抗體和顯色劑）
 
2準(zhǔn)備

1. 洗滌液的準(zhǔn)備

試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL去離子水稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內(nèi)可保存2周.

1. 酶標(biāo)記抗體的準(zhǔn)備

試劑盒中的標(biāo)記抗體是一種30倍濃縮物,根據(jù)所需量,用標(biāo)記抗體稀釋液稀釋30倍.
示例:
如果你用一條板（8孔）,就需800  μL.的標(biāo)記抗體.就用870  μL的標(biāo)記抗體稀釋液稀釋30  μL抗體濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL
濃縮酶標(biāo)記抗體需稀釋后才能用于實(shí)驗(yàn)
剩余的稀釋標(biāo)記抗體液需密封瓶裝,存于4°C

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

加1.0mL的去離子水到瓶裝標(biāo)準(zhǔn)品,制成濃度為7,200 pg/mL大鼠腫瘤壞死因子α標(biāo)準(zhǔn)品液

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋

準(zhǔn)備8支試管,并每支各加230 μL  EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,步驟如下圖所示:
試管1                           3600 pg/mL
試管2                            1800 pg/mL
試管3                                              900 pg/ mL
試管4                                               450 pg/mL
試管5                                               225 pg/mL
試管6                                             112.5 pg/mL
試管7                                              56.25pg/mL
試管8                                   0 pg/mL（樣品空白對照）
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品液于1號(hào)管混勻，然后從1號(hào)管吸取230ul加入2號(hào)管混勻，如下圖所示,按此規(guī)律稀釋，系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍為56.25-3600pg/mL,第8號(hào)管為0 pg/mL作為樣品空白對照

 

1. 樣品稀釋

 樣品如需稀釋時(shí),必須用EIA緩沖液進(jìn)行稀釋
 如果樣品中大鼠腫瘤壞死因子α的濃度范圍一無所知的話,預(yù)先準(zhǔn)備幾個(gè)不同稀釋梯度的樣品液來確定*的檢測濃度.
 
 
 
3實(shí)驗(yàn)步驟
使用前，將所有試劑應(yīng)平衡至室溫，大約30min，充分混勻，確保試劑質(zhì)量無改變，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測必須同時(shí)進(jìn)行.
 

試劑	待檢測樣品	標(biāo)準(zhǔn)品	樣品空白	試劑空白
	檢測樣品100ul	稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1-7管）100ul	EIA緩沖液（第8管）100ul	EIA緩沖液100ul
蓋板，于4°C下溫育過夜
洗板7次
酶標(biāo)抗體	100ul	100ul	100ul	-
蓋板，于4°C下溫育30min
洗板9次
顯色劑	100ul	100ul	100ul	100ul
室溫避光溫育30min
終止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加終止液后,30min內(nèi)于450nm處讀取OD值

1）設(shè)試劑空白對照，并于相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2）  確定好樣品空白對照孔，檢測樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，分別將100ul樣品對照品（8號(hào)管）、檢測樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品（1-7號(hào)管）加入到相應(yīng)的微孔中。
3）蓋板，4°C下溫育過夜
4）用洗滌瓶劇烈洗板,再加入稀釋洗滌液,靜置15-30秒,再*倒去孔內(nèi)反應(yīng)液
重復(fù)洗板7次.
zui后在吸水紙上拍干,去除殘留液滴
如用自動(dòng)洗板機(jī)洗板,先自動(dòng)洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次
5）除試劑空白對照孔外,其余每孔各加100ul酶標(biāo)抗體
6）蓋板，4°C下溫育30min
7）按照上述步驟4）洗板9次
8）  用一次性試管取所需量的顯色劑，各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染，勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9）室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會(huì)變成藍(lán)色
10）每孔各加100ul終止液，溶液顏色會(huì)變成黃色
11）擦去微孔板底部的污跡或水滴，確保微孔內(nèi)溶液無氣泡產(chǎn)生.加入終止液后30min內(nèi)于酶標(biāo)儀450nm處讀取結(jié)果
 
 
特別注意

1. 收集樣品后應(yīng)盡快檢測. 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復(fù)凍融.檢測前,將樣品解凍至室溫.
2. 如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
3. 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品建議做雙份檢測
4. 保持樣品處于中性PH范圍.有機(jī)溶劑的污染會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
5. 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果
6. 在吸水紙上拍干去除殘留液滴時(shí),切勿用吸水紙刮擦孔內(nèi)壁
7. 顯示劑應(yīng)避光保存并避免與金屬物質(zhì)接觸
8. 加終止液后,30 min內(nèi)就應(yīng)讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 
結(jié)果計(jì)算
所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（包括標(biāo)準(zhǔn)品,檢測樣品的OD值）,都應(yīng)減去樣品空白對照的OD值.
在log-log坐標(biāo)紙用,以較正的OD值為縱坐標(biāo),相對應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線. 樣品直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲取濃度值.
標(biāo)準(zhǔn)曲線示范

 
上圖所示典型標(biāo)準(zhǔn)曲線僅用于演示示范,不能用于試驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取.每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)建立其標(biāo)準(zhǔn)曲線.
 
常規(guī)事項(xiàng)
1所有試劑置于2 - 8°C保存.實(shí)驗(yàn)前將試劑平衡至室溫（約30分鐘）
2瓶裝標(biāo)準(zhǔn)品是凍干品,故小心打開瓶蓋
3終止液是強(qiáng)酸物質(zhì).使用時(shí),避免其接觸皮膚和衣膚.
4棄置用過的物質(zhì)前,用水沖洗
5 濃縮酶標(biāo)抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會(huì)出現(xiàn)沉淀,但這并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)
6使用試劑后應(yīng)洗手
7切勿混用不同批號(hào)的試劑
8別使用過期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷.
存儲(chǔ)與有效期
存儲(chǔ)條件:2 - 8°C
有效期見試劑盒外包裝
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)
 
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