人α–klotho ELISA Kit

（人可溶性α–klotho蛋白檢測試劑盒）

日本IBL*，貨號：27998
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人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白檢測試劑盒
前言簡介
α–klotho是經(jīng)基因改造（類似患有人衰老癥狀）小鼠體內(nèi)的一種負(fù)調(diào)節(jié)基因，其基因序列存在多個種屬，包括基于小鼠研究的人類，α–klotho蛋白是一種分子量約為130kDa的橫跨膜蛋白，在腎臟和甲狀旁腺內(nèi)表達(dá).
近年來，已證實α–klotho是機(jī)體調(diào)節(jié)礦物質(zhì)代謝的重要因子，如鈣和磷的代謝.因此認(rèn)為,小鼠幼齡老化癥狀就是因為α–klotho的缺失導(dǎo)致礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)破壞而引起的. 同時，據(jù)報道,構(gòu)成α–klotho蛋白序列主要部分的長N-端胞外域可經(jīng)分離釋放至血液.然而對于可溶性α–klotho蛋白發(fā)揮的功能和變化仍存很多疑點，所以急需研制一套α–klotho檢測系統(tǒng)
此ELISA試劑盒可用于檢測人血液的α–klotho蛋白
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白檢測試劑盒
實驗原理
此固相ELISA試劑盒基于夾心法原理，利用兩種不同的高特異性抗體，TMB作為底物顯示劑，顯色強(qiáng)度與人可溶性α–klotho的量成正比
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人可溶性α–klotho蛋白檢測試劑盒
檢測范圍
93.75~6000pg/mL
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人可溶性α–klotho蛋白檢測試劑盒
預(yù)期用途
此試劑盒可用于血清，血漿和尿液中人可溶性α–klotho的定量檢測
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人可溶性α–klotho蛋白檢測試劑盒
試劑盒組成
 

1. 包被板: 包被有抗人可溶性α–klotho（67G3）小鼠IgG單抗，親和純化      96T x 1
2. 濃縮標(biāo)記抗體

: （30X） HRP標(biāo)記的抗人可溶性α–klotho小鼠IgG Fab’親和純化              0.4ml x1
 

1. 標(biāo)準(zhǔn)品: 重組人可溶性α–klotho                                         0.5mlx2
2. EIA緩沖液:                                                           30mlx1
3. 標(biāo)記抗體稀釋液: 1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS                          12mlx1
4. 顯色劑:TMB底物液                                                    15mlx1
5. 終止液: 1N硫酸                                                       12mlx1
6. 濃縮洗滌緩沖液: （40X）含0.05%吐溫20的磷酸緩沖液                       50mlx1

人α–klotho ELISA Kit
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實驗所需材料（ 但試劑盒未提供）
酶標(biāo)儀（450nm）      微量移液管和加樣槍頭
量筒和燒杯            去離子水
吸水紙                坐標(biāo)紙
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管           洗瓶
一次性試管
人α–klotho ELISA Kit
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試劑準(zhǔn)備
 

1. 洗滌緩沖液的準(zhǔn)備：

先將（40X）洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得. 稀釋洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi)，2周內(nèi)用完
 

1. 酶標(biāo)記抗體的準(zhǔn)備：

用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋至30倍，即得
例：如果只測一條板，8孔，則需要標(biāo)記抗體800ul（30ul的標(biāo)記抗體+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔各加100ul）
此步驟應(yīng)在標(biāo)記抗體使用前完成
剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶內(nèi)，于4℃保存
 

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：

吸取0.5ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶內(nèi)，充分混勻，得到12000pg/ml的人可溶性α–klotho標(biāo)準(zhǔn)品
 

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：

準(zhǔn)備8個試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，各加230ul的EIA緩沖液, 配制成以下8管濃度
1號管                 6000pg/ml
2號管                 3000pg/ml
3號管                 1500pg/ml
4號管                 750pg/ml
5號管                 375pg/ml
6號管                 187.5pg/ml
7號管                 93.75pg/ml
8號管                 0pg/ml（試驗樣品空白）
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管混勻，如下圖所示,按此規(guī)律稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品范圍為6000~93.75pg/ml. 8號管作為樣品空白,濃度為0pg/ml.

 

1. 樣品稀釋：

根據(jù)要求,用EIA緩沖液稀釋樣品.血清,血漿或尿液樣品建議稀釋2~4倍
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實驗步驟
使用前，將所有試劑應(yīng)平衡至室溫，大約30min，充分混勻，確保試劑質(zhì)量無變化，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測同時進(jìn)行.
 

• 設(shè)試劑空白對照，并于相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液
• 確定好樣品空白對照孔，檢測樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的微孔中。
• 蓋板，室溫下溫育60min
• 用洗滌瓶洗板，在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒，棄去洗滌液。重復(fù)7次，zui后在吸水紙上拍干.

如用洗板機(jī)洗板4次，需再用洗瓶洗板3次
 

• 除試劑空白對照孔外,每孔各加100ul酶標(biāo)抗體
• 蓋板，室溫下溫育30min
• 按照上述步驟4）洗板9次
• 用一次性試管取所需量的顯色劑，各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染，勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
• 室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍(lán)色
• 每孔各加100ul終止液，溶液顏色會變成黃色
• 擦去微孔板底部的污跡或水滴，確保微孔內(nèi)溶液無氣泡.加入終止液后30min內(nèi)于酶標(biāo)儀   450nm處讀數(shù)

特別注意
 

1. 試驗樣品采集后應(yīng)立即檢測或凍存,避免反復(fù)凍融樣品,檢測前應(yīng)在低溫下先將其*溶解混勻

尤其是尿液樣品，溫度和凍融對其比血漿或血清穩(wěn)定性影響更大,所以樣品采集后應(yīng)立即凍存，避免重覆凍存
 

1. 試驗樣品根據(jù)所需,用EIA緩沖液稀釋
2. 建議各試驗樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做雙份檢測
3. 試驗樣品應(yīng)在中性PH范圍，有機(jī)溶劑的污染可能會影響實驗結(jié)果
4. 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板，不充足的洗滌會導(dǎo)致試驗失敗
5. 用吸水紙拍干微孔板，避免刮擦
6. TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬
7. 加入終止液后,30min內(nèi)必須讀數(shù)

 
 
 
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結(jié)果計算
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線前，所有的數(shù)據(jù)（包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知的樣品）都應(yīng)減去試驗樣品空白值.以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及相對應(yīng)OD值，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
 

此標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例演示,不能用于獲取試驗數(shù)據(jù).每次檢測都應(yīng)建立其標(biāo)準(zhǔn)曲線.
 
 
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本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。
 
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