苯丙氨酸（PKU）檢測(cè)試劑盒說明書

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苯丙氨酸（PKU）檢測(cè)試劑盒說明書

德國(guó)IBL進(jìn)口原裝，酶標(biāo)儀定量檢測(cè)

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中國(guó)SFDA注冊(cè)：國(guó)食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2010第3402924號(hào)

【產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)】YZB/GEM 1401-2010

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：苯丙氨酸檢測(cè)試劑盒

商品名稱：苯丙氨酸檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Phenylalanine （PKU） neonatal Screening Assay

【包裝規(guī)格】480人份/盒

【預(yù)期用途】

此試劑盒可用于新生兒血斑中L-苯丙氨酸的體外定量檢測(cè)。僅供新生兒苯丙酮尿癥的篩查。

苯丙酮尿癥（PKU）,是一種zui常見的氨基酸代謝遺傳病,它通過常染色體隱性遺傳給子代,在人群中的發(fā)病率為1/2600—1/25000。

發(fā)病的主要原因（90—99%病例）是苯丙氨酸羥化酶的活性降低或缺失。苯丙氨酸羥化酶可以使必需氨基酸苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸，后者是兒茶酚胺、黑色素和甲狀腺激素的前體，由于苯丙氨酸這個(gè)代謝的阻斷，因而通過旁路代謝轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸和乙酸鹽，通過腎臟排泄。

該疾病由于在出生后*周,病人代謝抑制就表現(xiàn)出來。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)代謝的改變引起大腦神經(jīng)纖維異常的髓鞘形成對(duì)疾病的發(fā)展起主要作用。苯丙酮尿癥的其它表現(xiàn)有（和附屬物）色素沉著的缺乏。是因?yàn)楹谏匦纬傻奈蓙y，因而引起皮膚病。

在新生兒中對(duì)苯丙酮尿癥的診斷是重要的,因?yàn)榭赏ㄟ^低苯丙氨酸膳食避免腦損害。因而測(cè)定血中苯丙氨酸濃度的篩查試驗(yàn)，應(yīng)在出生后3—5天進(jìn)行，假如為陽性，應(yīng)通過檢測(cè)染色體特異的突變來進(jìn)行確證試驗(yàn)。

為了檢驗(yàn)苯丙酮尿癥病人發(fā)展了許多篩查試驗(yàn)，zui早的試驗(yàn)是由GUTHRIE 發(fā)明命名的，以枯草桿菌的生長(zhǎng)習(xí)性來檢測(cè)，枯草桿菌只能在高苯丙氨酸濃度生長(zhǎng)。因?yàn)樵摲椒ǖ脑S多缺陷被其它的一些試驗(yàn)替代，這些實(shí)驗(yàn)是利用病人血液中的苯丙氨酸參與的化學(xué)反應(yīng)，利用熒光或顯色底物，進(jìn)行測(cè)定。也可以應(yīng)用更可信、更靈敏、更的高壓液相色譜檢測(cè)。

【檢驗(yàn)原理】

將血斑紙上的苯丙氨酸用3%的三氯乙酸從濾紙上洗脫。

樣本中的苯丙氨酸在外加苯丙氨酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成苯丙酮酸鹽，此反應(yīng)使存在于反應(yīng)混合物中的輔酶NAD+再生。產(chǎn)生的NADH 使加入的黃色Tetrazalium 鹽發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成紫色物質(zhì)Formazane，在570nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，OD值與病人樣本中的苯丙氨酸濃度成正比。

【主要組成成分】

1、試劑盒成分

RE80015	標(biāo)簽	成分
1×	ENZ LYO	酶，凍干粉，內(nèi)含苯丙氨酸脫氫酶，輔酶NAD+，緩沖掖，穩(wěn)定劑
1×45ml	ENZDIL	酶稀釋液，即用，內(nèi)含二乙醇胺，緩沖液，0.01%的NaN₃
1×55ml	SUBS	底物，即用，內(nèi)含四唑鹽和檸檬酸鹽。
1×5	CAL A-E	標(biāo)準(zhǔn)品A～E：1;3;6;12;18mg/dl，用2.EWS進(jìn)行校準(zhǔn)。內(nèi)含人血液，Schleicher & Schuell濾紙編號(hào)：903.15血斑紙片。具體濃度請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽或質(zhì)控單。
1×2	CONTROL 1+2	質(zhì)控品 1+2 質(zhì)控品1：1.8-3.0mg/dl 質(zhì)控品2：4.0-6.0mg/dl 內(nèi)含人血液，Schleicher & Schuell濾紙編號(hào)：903.15血斑紙片。具體濃度及可接受范圍請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽或質(zhì)控單
1×2ml	DYE CONC	顯色儲(chǔ)存液，51倍濃縮型，內(nèi)含酸性黃23（C.I.19140）

2、實(shí)驗(yàn)需要但試劑盒不提供器材

1）移液器（多道移液器或類似儀器：＜3% CV），體積：25;75;100;600;1000ul。

2）圓底聚苯乙烯試管（12×75mm）

3）試管架

4）試管振蕩器

5）三氯乙酸（3%；w/v），用99.5%的三氯乙酸配得

6）0.5M的NaOH溶液

7）血液采集紙片（建議使用Schleicher & Schuell 903）

8）血斑打孔器，5mm（1/5´´）（例如：Sauer，Hannover，Germany）

9）微孔板（平底）

10）微孔板振蕩器（300-500rpm，振幅：1.5-3.0mm）

11）可在570nm讀數(shù)的酶標(biāo)儀（參比波長(zhǎng)：690nm）

12）雙蒸水或去離子水

13）吸水紙，取樣吸頭和計(jì)時(shí)器

【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑盒應(yīng)當(dāng)儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下，避免太陽直射，有效期內(nèi)穩(wěn)定。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定及試劑的準(zhǔn)備將在相關(guān)單元中說明。有效期見試劑盒標(biāo)簽。

【使用儀器】通用酶標(biāo)儀（配有570nm濾光片）

【樣本要求】

血斑

應(yīng)當(dāng)從嬰兒足跟的中部或內(nèi)測(cè)收集足跟血,注意血液采集的常規(guī)注意事項(xiàng).刺破足跟后,*滴血應(yīng)當(dāng)用消毒紗布擦去.將采集卡對(duì)準(zhǔn)血滴,讓足量的血滲入到吸水紙上并充分填滿預(yù)先印好的圓圈。重復(fù)操作，將所需數(shù)目的血斑都制備好。將血斑室溫下涼干3小時(shí)，避免太陽直射。
注意	因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品是用Schleicher & Sshcuell No. 903濾紙確定的，所以濾紙的材料會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們建議您也使用Sshleicher這種紙片。采血時(shí)請(qǐng)勿擠壓穿刺部位，因?yàn)閿D壓會(huì)早成溶血或組織液稀釋血液。不要在采血圈內(nèi)連續(xù)滴血。請(qǐng)勿接觸或涂抹血斑。確保血斑樣品看上去符合實(shí)驗(yàn)要求（例如：血無涂抹，無凝塊，血斑上無指紋）。
注意	樣品應(yīng)當(dāng)在嬰兒出生后第三天到第五天的時(shí)間內(nèi)采集。（出生后72到120小時(shí)內(nèi)）。出生不到72小時(shí)就采集的樣品可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
儲(chǔ)存	2-8℃	避免熱源和太陽直射
穩(wěn)定性	6個(gè)月

【檢驗(yàn)方法】

1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（1）酶儲(chǔ)存液的準(zhǔn)備

注意	配置好的酶儲(chǔ)存液在2-8℃可穩(wěn)定存放5天。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)實(shí)際所需要的酶反應(yīng)液即可。
	在每支凍干的酶試劑瓶?jī)?nèi)加入12ml雙蒸水，蓋好試劑瓶，輕輕混合以使其充分溶解，混合2分鐘，混合時(shí)避免起泡。

（2）酶溶液的準(zhǔn)備

注意

如果您使用了好幾支酶儲(chǔ)存液，我們建議您將各管稀釋液混合并確定混合液的濃度.重新配置好的酶儲(chǔ)存液在18-25℃可穩(wěn)定存放8小時(shí)，儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下也不能延長(zhǎng)它的有效期

酶溶液的建議配制量：

反應(yīng)板數(shù)	1/3	2/3	1	2	3	4	5
酶儲(chǔ)存液（mL）	0.8	1.6	2.4	4.8	7.2	9.6	12
稀釋液（mL）	2.7	5.3	8.0	16	24	32	40

按照上述表格用稀釋液稀釋酶儲(chǔ)存液，充分混合2min，混合時(shí)避免起泡

（3）有色三氯乙酸（3%）的準(zhǔn)備

用3%三氯乙酸按1：51的比例稀釋顯色儲(chǔ)存液（如：加2ml濃縮型的染色儲(chǔ)存液到100ml3%的三氯乙酸中。配置好的三氯乙酸在18-25℃的環(huán)境下有效期內(nèi)穩(wěn)定。

（4）血斑的洗提

	用打孔器打下標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品血斑紙片（直徑5mm），分別放到相應(yīng)的聚苯乙烯試管中，標(biāo)上標(biāo)簽
	在每一試管中加入100ul 3%三氯乙酸，確保每一紙片都被溶液浸沒。
	振蕩器（300-500rpm，振幅：1.5-3mm）上室溫（18-25℃）溫育30-60分鐘。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

1	在微孔板的每一微孔中加入25ul 0.5M的NaOH溶液。
2	將75ul標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和血斑樣品洗提液分別加入到相應(yīng)的微孔中,稍振板以便混合均勻
3	在每一微孔中加入100ul臨時(shí)配置好的酶溶液
4	室溫（18-25℃）下溫育30分鐘
5	在每一微孔中加入100ul底物溶液，振蕩器（300-500rpm，振幅：1.5-3mm）上振蕩3分鐘
6	加入底物后3-5分鐘內(nèi)570nm處讀取OD值

【參考值（參考范圍）】

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

1、結(jié)果計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為Y軸（線形）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為X軸（對(duì)數(shù)）做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用線形回歸曲線來做。用計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算時(shí)，用2點(diǎn)線形回歸方程得到的曲線。計(jì)算回歸曲線時(shí)，用每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值來畫標(biāo)準(zhǔn)曲線（數(shù)值明顯偏離的應(yīng)當(dāng)忽略不要，并使用更接近的數(shù)值來做標(biāo)準(zhǔn)曲線）。樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接讀取。樣品所顯示信號(hào)高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用參考方法進(jìn)行確認(rèn)。

轉(zhuǎn)換系數(shù)：1mg/dl=60.5μmol/L

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線（范例，請(qǐng)勿用其定標(biāo)）

標(biāo)準(zhǔn)品	苯丙氨酸（mg/dl）	平均OD值
A	0.61	0.039
B	2.61	0.074
C	5.81	0.108
D	11.61	0.186
E	17.61	0.283

2、結(jié)果說明

如果血斑樣品中苯丙氨酸的濃度高于3.3mg/dl（=平均值+3倍的標(biāo)準(zhǔn)差）的樣品認(rèn)為是“假陽性”樣品，如果苯丙氨酸的期望值呈正態(tài)分布的話，則3%的受檢人群必須重復(fù)檢測(cè)。如果再次檢測(cè)的結(jié)果仍高于3.3mg/dl，則應(yīng)當(dāng)再采集新樣品并用證實(shí)實(shí)驗(yàn)分析。關(guān)于新生兒篩查的各種團(tuán)體都建議：TSH的重復(fù)檢測(cè)應(yīng)使用不同的臨界值，而且應(yīng)當(dāng)應(yīng)用證實(shí)實(shí)驗(yàn)。鑒于每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都使用不同群體的新生兒樣品，我們強(qiáng)烈建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室確定自己實(shí)驗(yàn)室的正常值范圍，而且其數(shù)值分布應(yīng)當(dāng)與當(dāng)?shù)叵鄳?yīng)社會(huì)團(tuán)體的建議數(shù)值一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果本身僅僅是確定治療結(jié)果的一個(gè)因素，它必須與臨床癥狀及診斷檢測(cè)相結(jié)合。

【檢驗(yàn)方法的局限性】

樣品的采集對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有明顯的影響，具體如何采集樣品請(qǐng)見“樣品的采集與儲(chǔ)存”。

篩查檢測(cè)中，血斑中苯丙氨酸濃度提高的結(jié)果都被認(rèn)為是“假定陽性”樣品，應(yīng)當(dāng)再次取樣并重新檢測(cè)。不能*排除實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性結(jié)果的可能。有苯丙酮尿癥既往病史或臨床癥候的樣品應(yīng)當(dāng)重復(fù)檢測(cè)。如果苯丙酮尿癥的病人接受了藥物治療，那么我們不能排除藥物對(duì)苯丙氨酸結(jié)果的直接影響。因此，在上述那些情況下，如果病人有苯丙酮尿癥的既往病史或臨床征候，我們強(qiáng)烈建議您用證實(shí)實(shí)驗(yàn)確定正常的苯丙氨酸值。建議血斑樣品取樣時(shí)使用S&S903濾紙片。如果使用其它的濾紙片，應(yīng)當(dāng)考慮其相應(yīng)的矯正因子。例如，使用2992濾紙片會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生20%的不同：標(biāo)準(zhǔn)品（2992）=1.2×（S& S903）+0.181；相關(guān)系數(shù)=0.996；數(shù)量=349

至于交叉反應(yīng)，請(qǐng)見“產(chǎn)品性能指標(biāo)”。

如下血液成分濃度高于下述濃度時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生明顯影響（±15%）：

血紅蛋白	5mg/dl
膽紅素	500mg/dl
甘油三酯	3000mg/dl

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

分析特異性（交叉反應(yīng)）	用有交叉反應(yīng)的典型物質(zhì)檢測(cè)，沒發(fā)現(xiàn)有交叉反應(yīng)
靈敏度分析（檢測(cè)極限）	1.55mg/dl	靈敏度分析：20%；y=26.33×^-0.6304 R²=0.82
精密度	范圍（mg/dl）	CV（％）
板內(nèi)差異	2.68-9.6	5.8-11.0
板間差異	2.79-9.36	6.4-15.1
線形度	樣品中苯丙氨酸濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)當(dāng)用其它參考方法進(jìn)行證實(shí)。樣本稀釋是不可能的，因?yàn)橄♂層脽o苯丙氨酸血不存在。而無苯丙氨酸的血液浸膏劑做稀釋液可能會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。
重現(xiàn)性	平均值（U/ml）	范圍（%）	加入已知濃度樣品后的重現(xiàn)性%
重現(xiàn)性	101	91-127	加入已知濃度樣品后的重現(xiàn)性%
與其它實(shí)驗(yàn)方法比較	IBL檢測(cè)=0.88×其他檢測(cè)-0.21		r=0.95；n=98

【注意事項(xiàng)】

1、注意事項(xiàng)與預(yù)防措施

1）試劑僅供體外診斷和專業(yè)人士使用。

2）在檢測(cè)開始之前，仔細(xì)和完整的閱讀說明書，使用試劑盒提供的說明書的有效版本，確保所有的程序都清楚。尋求更多信息（比如：臨床背景，檢測(cè)操作，自動(dòng)化操作說明，可選擇的軟件，文獻(xiàn)等等），請(qǐng)查看IBL公司主頁。

3）如果試劑盒有破壞的請(qǐng)與IBL公司或供應(yīng)商以書面方式，但自您拿到試劑盒后zui遲不超過一個(gè)星期。在檢測(cè)時(shí)請(qǐng)不要使用受損的試劑，以確保自身安全。

4）按照批號(hào)和有效期，不要混合使用不同批號(hào)的試劑，也不要使用過期的試劑。

5）遵守實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化管理規(guī)則和安全指南，穿實(shí)驗(yàn)服，帶橡皮手套，有必要時(shí)請(qǐng)戴護(hù)目鏡。

6）這種試劑盒中含有會(huì)傷害眼睛和皮膚的有害試劑，請(qǐng)閱讀材料來源和標(biāo)簽獲取詳細(xì)信息。產(chǎn)品的材料安全數(shù)據(jù)能夠從IBL公司主頁上下載或直接向IBL公司索取。

7）根據(jù)國(guó)家生物有害物質(zhì)及安全條例，所有化學(xué)藥品和準(zhǔn)備或使用過的試劑都應(yīng)當(dāng)做有害物質(zhì)進(jìn)行處理。

8）此試劑中用到的標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品的人血成分經(jīng)乙肝表面抗原，抗-HCV抗體，抗-HIV1+2抗體檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性，但是試劑中會(huì)出現(xiàn)此類病毒（HIV/II，HbsAg和HCV）或其他具有感染性的病原體的可能性都不能*被排除。因此，所有的試劑在使用和處理的過程中都應(yīng)當(dāng)作潛在生物有害物質(zhì)進(jìn)行處理。

2、實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：

1）樣品的不合理處理及實(shí)驗(yàn)操作的任何改動(dòng)都將影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。取樣體積、溫育時(shí)間、預(yù)處理步驟都必須嚴(yán)格按說明進(jìn)行。只能使用標(biāo)準(zhǔn)取樣器和標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備。

2）一旦實(shí)驗(yàn)開始，所有的步驟都必須完整的進(jìn)行下去，不允許中斷。把所有試劑和樣品都拿到18-25℃的實(shí)驗(yàn)室中，在使用前，輕輕搖動(dòng)液體試劑和樣品，試劑混合過程中要避免氣泡。

3）請(qǐng)勿接觸試劑、取樣器、微孔/試管。加試劑和樣本時(shí)，請(qǐng)使用新的取樣吸頭，以避免交叉污染。不用的試劑應(yīng)用蓋子蓋好，以免重復(fù)使用。

4）為了消除潛在的加樣誤差，建議每份樣品都做雙份檢測(cè)。

5）用加液記錄表格核對(duì)反應(yīng)板上的排列順序。

6）溫育時(shí)間會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。微孔加樣的順序和時(shí)間都必須一致。建議使用8道移液器向微孔加樣。

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