人H1N1 抗體（IgG）ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑盒僅供研究使用

特異性：本試劑盒可檢測(cè)人H1N1 特異性IgG，與其他相關(guān)抗體無(wú)交叉反應(yīng)。

有效期：6 個(gè)月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA 法半定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中H1N1 IgG 含量。

說(shuō)明

    1．試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

    2．濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

    3．中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

    4．剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造

       成任何影響。

實(shí)驗(yàn)原理

    用甲型H1N1 流感病毒 （H1N1 ）的HA 蛋白包被酶標(biāo)板，制成固相載體。向微孔中先加入待測(cè)樣品進(jìn)行反應(yīng)，然后再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG                           進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的H1N1 IgG 抗體呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品中抗體的效價(jià)（抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數(shù)記為效價(jià)）。
試劑盒組成及試劑配制

1.  酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96 孔）。

2.  樣品稀釋液（Sample Diluent） ：1×20ml/瓶。

3.  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG 稀釋液 （HRP-anti-human IgG Diluent）：1×10ml/瓶。

4.  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG  （HRP-anti-human IgG）：1×120μl/瓶（1：100）。

5.  底物溶液 （TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

6.  濃洗滌液 （Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

7.  終止液 （Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.  高速離心機(jī)

3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6.  蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存

1.  血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2 小時(shí)或室溫過(guò)夜后于1000 x g 離心20 分鐘，取上清即

可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.  血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 -  8° C 1000 x g 離心15 分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000   x   g 離心20 分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過(guò)程中，

應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算抗體效價(jià)時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本中抗體的效價(jià)為“N”。

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG 的稀釋原則： 臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG                稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG 加990μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG 稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。

如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。

1.  加樣：分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100μl，余孔加待測(cè)樣品100μl， 注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 分鐘。

2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG 工作液 100μl（取1μl 生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃，60 分鐘。

3.  溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.  依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30 分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)孔內(nèi)有明顯藍(lán)色，

即可終止）。

5.  依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量

與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入

終止液。

6.  用酶聯(lián)儀在450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液后15 分鐘以內(nèi)

進(jìn)行檢測(cè)。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H SO4。

   測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD 值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG 工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人IgG 工作液。

5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，

酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

計(jì)算

為檢測(cè)樣品中H1N1 IgG 抗體效價(jià)，客戶可以采取樣品2 倍倍比稀釋樣品計(jì)算抗體效價(jià)，一般采取以1:40 為起始稀釋倍數(shù)（使用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋）。zui大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗(yàn)要求而定，zui終顯色與陰性對(duì)照孔進(jìn)行比較，有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效

注意事項(xiàng)

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。

3. 一次加樣時(shí)間控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5. 在配制檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6. 底物請(qǐng)避光保存。

7. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

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