ELISA法檢測立克次體

    立克次體（Rickettsia）是一類專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞微生物，具有細(xì)胞壁，含有RNA和DNA，以二分裂繁殖。需在細(xì)胞內(nèi)繁殖，不能在無細(xì)胞的人工培養(yǎng)基中生長。它是屬于人獸共患的自然疫源性疾病。臨床上常見的有普氏立克次體、莫氏立克次體、恙蟲病立克次體和Q熱立克次體等，它傳播的疾病主要是斑疹傷寒、恙蟲病和Q熱。檢測血清中立克次體的特異性方法包括：免疫熒光法、ELISA、間接血凝法、乳膠凝集法和微量凝集法等。ELISA法特異性強(qiáng)、敏感性高、可重復(fù)性好，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于檢測各種立克次體感染，但其缺點(diǎn)是需要使用純化的抗原。本節(jié)僅對Q熱立克次體抗體ELISA法進(jìn)行介紹。

    [檢測方法]ELISA法

    [方法學(xué)原理，  將可溶Q熱立克次體吸附于固相載體上，洗去未吸附的抗原，加入待檢血清使其與載體上吸附的抗體連接，洗滌后加入酶標(biāo)記的抗人血清球蛋白，溫育后漂洗，加底物溶液，底物降解出現(xiàn)呈色反應(yīng)，顏色改變的程度與待檢血清的含量成正比。

    [標(biāo)本準(zhǔn)備]

    取新鮮末梢血或靜脈血。如采血后24h內(nèi)不能進(jìn)行試驗(yàn)，分離血清后將其保存于-20℃環(huán)境中。檢測時(shí)，使樣本恢復(fù)至室溫。

    [試劑]

    1．0．05mol／LpH 7．4 PBS-Tween-20

    2．0．01mol／LpH 9．6碳酸鹽緩沖液

    3．HRP標(biāo)記抗人球蛋白血清

    4．鄰苯二胺底物溶液

    5．2mol／L H2S04

    6．純可溶性Ⅱ相Q熱立克次體抗原（制備方法見微量凝集試驗(yàn)檢測Q熱立克次體抗體）

    [儀器）  酶標(biāo)儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。

    （檢測步驟]

    1．用0．05mol／LpH 9．6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原使成每毫升含蛋白10／1g左右，包被酶標(biāo)板，每孔0．2ml，于37℃環(huán)境中2h后，于4℃環(huán)境中過夜。

    2．用0．01mol／L pH 7．4 PBS-Tween—20洗3次，用于。

    3．被檢血清經(jīng)含1g／L牛血清清蛋白的PBS-Tween-20作l：200稀釋，加人相應(yīng)孔中，同時(shí)加2孔已知陽性對照和2孔陰性對照，放37℃環(huán)境中2h。

   4．用0．Olmol／L pH 7．4 PBS-Tween—20洗3次，甩干。

    5．加酶標(biāo)記抗體，每孔0．2ml，37℃環(huán)境中2h。

    6．用0．01mol／L pH 7．4 PBS-Tween-20洗3次，甩干。

    7．加底物溶液，每孔0．2ml，室溫避光保存15—30min，各孔加入2mol／l H2S04 1滴終止反應(yīng)，用酶標(biāo)光度計(jì)490nm測每孔吸光度值（A值）。

    （正常參考值]  Q熱立克次體抗體陰性

    [注意事項(xiàng)）

    1．可溶性抗原必須純凈，否則影響結(jié)果。

    2．每次試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)做2份陽性及2份陰性對照。

    3．其他注意事項(xiàng)同檢測HBsAg的ELISA。

    [臨床意義]

    1．血清診斷為Q熱zui常用的特異性診斷方法，其特異性很高，未發(fā)現(xiàn)與其他疾病有交叉反應(yīng)。

2．在發(fā)病過程中，Q熱抗體滴度不斷增長，恢復(fù)期抗體水平高于急性期4倍以上，則對確診Q熱有重要意義。

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    3．Q熱現(xiàn)癥診斷主要依據(jù)Ⅱ相抗體水平的上升。一般來說，發(fā)病1周左右血清中即有Ⅱ相補(bǔ)體結(jié)合抗體出現(xiàn)。若第1相抗體一直保持較高水平，或第1相抗體滴度高于第Ⅱ相滴度，則往往說明感染仍然存在。如患者血清Ⅱ相抗體滴度超過1：200提示為慢性Q熱，特別在伴有感染性心內(nèi)膜炎時(shí)更有意義。

    4．1977年，Cracea等提出，在Q熱急性期Ⅱ相抗原的微量凝集試驗(yàn)陽性率達(dá)85．3％。