大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P） ELISA試劑盒使用說(shuō)明書

     本試劑僅供研究使用                  
目的：本試劑盒用于測(cè)定血清，血漿及相關(guān)液體樣本中大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P）的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：

   本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli   P）水平。用純化的

大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次

加入大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P），再與HRP 標(biāo)記的E.coli P  抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-

酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色， 并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大腸桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P） 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大腸

桿菌宿主殘留蛋白（E.coli P）濃度。

試劑盒組成：

    試劑盒組成                 48 孔配置                96 孔配置                保存

      說(shuō)明書                   1 份                    1 份

      封板膜                2 片（48 ）               2 片（96）

      密封袋                   1 個(gè)                    1 個(gè)

    酶標(biāo)包被板                   1×48                  1×96             2-8℃保存

  標(biāo)準(zhǔn)品：36ng/L             0.5ml×1 瓶              0.5ml×1 瓶          2-8℃保存

   標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液                1.5ml×1 瓶              1.5ml×1 瓶          2-8℃保存

     酶標(biāo)試劑                 3 ml×1 瓶              6 ml×1 瓶           2-8℃保存

    樣品稀釋液                 3 ml×1 瓶              6 ml×1 瓶           2-8℃保存

    顯色劑A 液                3 ml×1 瓶              6 ml×1 瓶           2-8℃保存

    顯色劑B 液                3 ml×1 瓶              6 ml×1 瓶           2-8℃保存

      終止液                 3ml×1 瓶               6ml×1 瓶            2-8℃保存

  20 倍濃縮洗滌液              20ml ×1 瓶              23ml ×1 瓶          2-8℃保存

樣本處理及要求：

1.  血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上

   清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后，離心

   20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次

   離心。

3.  尿液：用無(wú)菌管收集，離心20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程

   中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS                     （PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞

   濃度達(dá)到100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20 分

   鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?/span>

   用。標(biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS                        （PH7.4），用手工或勻漿器

   將標(biāo)本勻漿充分。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待

   檢測(cè)，其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上

   進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP ）活性。

操作步驟

1.  標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)

    準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二

    孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，

    混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉，再各取50μl 分別加到第五、第六孔

    中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各

    取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混

    勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)

    品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，

    濃度分別為24ng/L，16ng/L  ，8ng/L，4ng/L， 2ng/L）。

2.  加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣

    品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl （樣

    品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混

    勻。

3.  溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

4.  配液：將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用。

5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此

    重復(fù)5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.  溫育：操作同3。

8.  洗滌：操作同5。

9.  顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

    15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止

    液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意事項(xiàng)：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未

   用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間

   控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD 值

   大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請(qǐng)避光保存。

7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

10.  如與英文說(shuō)明書有異，以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。

計(jì)算：

    以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，

    在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD

    值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋

    倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)

    準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值

    代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋

    倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

                                                              （此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為0.990 以上。

2.批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和11%

檢測(cè)范圍：

   1ng/L -30ng/L

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6 個(gè)月

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