酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)的多酶級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)

一、AP底物放大系統(tǒng)（substrate ampiification system）

    AP可催化底物NADP⁺脫磷酸而生成NAD⁺（輔酶1），以乙醇作還原劑，在醇脫氧酶催比下，乙醇脫氫，NAD⁺還原為NADH，NADH在黃遞酶的催化下脫氫，同時(shí)四唑鹽（tetrazoliim）被還原成有色的甲蠟（formazan）。AP不斷催化NAD⁺生成，NAD⁺與NADH循環(huán)轉(zhuǎn)化，不斷生成甲蠟。整個(gè)反應(yīng)周期由AP及醇脫氫酶、黃遞酶組成酶級(jí)聯(lián)，每個(gè)AP分子每分鐘可催化生成6X10⁴個(gè)NAD⁺分子，而每個(gè)NAD⁺每分鐘又可使60個(gè)甲臘分子產(chǎn)生。這種由Selfl984年報(bào)道的EIA放大系統(tǒng)可使EIA的測(cè)定敏感性提高約250倍。

但Brooks等發(fā)現(xiàn)上述底物反應(yīng)循環(huán)中產(chǎn)生的乙醛對(duì)整個(gè)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)有抑制作用，影響放大效果，而當(dāng)加入鹽酸氨基脲時(shí)，則可進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)循環(huán)，從而增加測(cè)定敏感性，這是因?yàn)辂}駿氨基脲可與乙醛反應(yīng)生成縮氨基脲（semicarbatone）和水，這樣就消除了乙醛對(duì)反應(yīng)的抑制阼用。應(yīng)用這種改進(jìn)方法測(cè)定食物中含蛋白A的金黃色葡萄球菌，測(cè)定敏感性從Self原方法的（4～6）X103菌落形成單位（c．{．u）／g或m1，到20個(gè)菌落形成單位（c．f．u）／g或ml，測(cè)定敏惑性約提高200—300倍。

    后來(lái)Self等又用刃天青（resazurin）代替其原來(lái)放大模式中的四唑鹽，刃天青在黃遞酶的作用下成為發(fā)出熒光的resorufin，然后使用熒光比色計(jì)測(cè)定得到結(jié)果。這種方式的測(cè)定敏感性也較原始方法大為提高，每孔內(nèi)僅含約350個(gè)AP分子也可測(cè)出。

二、雙酶級(jí)聯(lián)（dual-enzyme cascade）放大系統(tǒng)

    雙酶級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)又稱酶抑制級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，酯酶抑制劑4—（3—氧—4，4，4—三氟丁基）苯磷駿鹽因其帶有封閉性—P04基團(tuán)，對(duì)酯酶不具抑制活性，但當(dāng)其在AP作用下脫—PO₄基時(shí)，失活的抑制劑即成為具活性的抑制劑，使加入的羧酸酯酶失活，通過(guò)顯色反應(yīng)測(cè)定殘留的酯酶活性即可知原始AP的活性，二者成反比相關(guān)。這種放大系統(tǒng)的測(cè)定敏感性較普通方法可提高約125倍。

三、酶激活級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)（enzymeactivationcascade）

    這亦是一種以AP為標(biāo)記酶的放大系統(tǒng)。黃素—腺嘌呤二核苷酸磷酸（FADP）在AP的催化下脫磷酸為FAD，FAD則使脫輔基的氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化為全酶的氨基酸氧化酶，后者催化晡氨酸生成H₂O₂，于是在DCHBS，4AAP及HRP存在下，得到有色產(chǎn)物。上述放大系統(tǒng)可測(cè)定l{mol／LAP。

    此外，催化指示物沉著（catalyzedreporterdeposition，CARD）也是一種多酶級(jí)聯(lián)EIA放大系統(tǒng)。HRP氧化生物素或熒光素標(biāo)記的酪胺所產(chǎn)生的游離基，可與固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反應(yīng)而使大量的生物素或熒光素沉著于固相上HRP周圍的區(qū)域內(nèi)，沉著的生物素可用HRP及6—半乳糖苷酶或AP標(biāo)記的鏈霉親合素測(cè)定，沉著的熒光素則可用酶標(biāo)抗熒光素測(cè)定。這樣使得一分子HRP轉(zhuǎn)化為大量的標(biāo)記物，從而大為改善（約30倍）EIA的測(cè)定敏感性。Diamandis等使用螯合的Eu³⁺鏈霉親合素—甲狀腺球蛋白試劑替代上述酶標(biāo)物測(cè)定AFP，不但提高了測(cè)定敏感性，而且也使背景“噪聲”較普通方法改善了6～8倍。我們將上述CARD放大系統(tǒng)直接用于HBsAg商品ELISA試劑盒，在不改變商品試劑盒任何成分和操作步驟的情況下，可將試劑盒的測(cè)定敏感性提高約5倍。

四、凝固因子酶級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)

    脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）可激活鱟血細(xì)胞裂解物的凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)。首先LPS使因子C激活為C，后者又激活因子B為B，B使前凝固酶轉(zhuǎn)化為凝固酶，凝固酶則催化底物（Boc-Le，u-Gly-Arg-p）產(chǎn)生有色的對(duì)硝基苯胺（曠nitroa·niline，PNA），A405nm測(cè)定。因此，在免疫測(cè)定中，如以LPS作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體，則可通過(guò)上述反應(yīng)使測(cè)定敏感性放大，可檢出10^-7～10^-11g／m1的IgG和10^-7～10^-11g／ml的抗IgG，Seki等將上述方法用于雙夾心法檢測(cè)HBsAg，敏感性達(dá)10^-10～10^-12g／ml。

五、免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移兩位點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)

    一般來(lái)說(shuō)，在酶免疫測(cè)定中，限制測(cè)定敏感性的一個(gè)重要因素是非特異地結(jié)合于固相的標(biāo)記酶的顯色反應(yīng)，因其會(huì)使背景顯色加深，從而掩蓋了低濃度待測(cè)物所致的特異顯色，解決這個(gè)問(wèn)題提高測(cè)定敏感性的一條途徑是將待測(cè)物——抗體—酶復(fù)合物從固相上洗提至另一個(gè)固相，使用一雙標(biāo)抗體[如生物素和二硝基苯（DNP）標(biāo)記的抗體]和一酶標(biāo)抗體即可達(dá)到這個(gè)目的，在液相中形成的免疫復(fù)合物（雙標(biāo)抗體：抗原：抗體：酶）捕獲于DNPIgG包被的聚苯烯珠上，洗滌后，使用二硝基苯—L—賴氨酸將其從固相上取代下來(lái)，然后再將上述免疫復(fù)合物捕獲于鏈霉親合素包被的聚苯烯珠上，zui后進(jìn)行酶反應(yīng)顯色測(cè)定。Hashida和shikawa使用該方法測(cè)鐵蛋白敏感性達(dá)到1zeptomole（1X10^-21mol，約600個(gè)分子），較常規(guī)方法提高了30倍。眾多的研究者用該方法測(cè)定抗甲狀腺球蛋白IgC及抗HTLV—1 IgG和抗HIV-1 IgG，敏感性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)地超過(guò)常規(guī)方法，取得了良好的效果。

    此外，Domingo和Marco等在進(jìn)行點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)時(shí)，以4—氯—1—萘酚作為HRP的底物，反應(yīng)后得到的不可溶產(chǎn)物因其具有特殊的紫外吸收及熒光幻滅特征而可在紫外燈下觀察結(jié)果。由于沉著于膜上的物質(zhì)是HRP反應(yīng)的中間產(chǎn)物，而非可見(jiàn)光下能見(jiàn)到的zui終產(chǎn)物，所以可大幅度地提高這種固相免疫測(cè)定的敏感性，較常規(guī)方法約增加100倍。至于酶脂質(zhì)體放大系統(tǒng)（1iposomeamplificat*tem），也是一種新型的EIA測(cè)定放大系統(tǒng)。

    綜上所述，EIA測(cè)定放大方式雖然多種多樣，且不斷推陳出新，但研究者的出發(fā)點(diǎn)無(wú)非是一方面極力降低影響測(cè)定敏感性的非特異顯色，如通過(guò)增加操作步驟而達(dá)到上述目的的免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移兩位點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)；另一方面則是通過(guò)質(zhì)量提高的信號(hào)，從而達(dá)到提高敏感性的目的，如增加反應(yīng)層次的生物素—親合素，多酶級(jí)聯(lián)等放大系統(tǒng)。但嚴(yán)格地講，真正稱得上是EIA測(cè)定放大系統(tǒng)的于后者，前者還只能說(shuō)是一種所謂的超敏感EIA（uhrasensitive  enzyme immunoassay）。至于利用酶反應(yīng)產(chǎn)物特征改變檢測(cè)手段（如發(fā)光或熒光檢測(cè)）而使EIA測(cè)定敏感性提高，則只不過(guò)是依靠?jī)x器開(kāi)闊了“視野“而已。

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