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馬淑偉  李倩  楊定忠  朱旭東  孫永超

  （天津博納艾杰爾科技有限公司）

摘要：氨基酸分析是飼料中含氮量測(cè)定和蛋白質(zhì)含量測(cè)定的一種重要輔助手段，隨著反相色譜技術(shù)的發(fā)展，采用反相HPLC色譜測(cè)定氨基酸越來(lái)越普遍。本文使用Venusil-AA氨基酸分析方法包建立了飼料中氨基酸分析的HPLC方法，在50-1250nmol/mL的濃度范圍內(nèi)，18種氨基酸具有良好的線性范圍，相關(guān)系數(shù)r大于0.999，檢測(cè)限約為5pmol，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，并且通過(guò)使用不同的HPLC儀器驗(yàn)證了該方法具有良好的耐用性。

液相色譜儀（配制要求：可梯度洗脫，紫外檢測(cè)，可控柱溫）； Venusil-AA氨基酸分析方法包（天津博納艾杰爾科技，包括：Venusil AA氨基酸分析柱1支，4.6×250mm，5μm；PITC異硫氰酸苯酯衍生劑10瓶，25μL/瓶；含17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液2瓶，2mL/瓶；內(nèi)標(biāo)物正亮氨酸1瓶，100mg/瓶；衍生溶媒三乙胺2瓶，1.4mL/瓶）；塑料離心管，1.5mL；實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)；樣品篩: 孔徑0.25mm；離心機(jī)；真空泵 ；恒溫干燥箱；水解管：安瓿瓶體積20～30mL（用去離子水沖洗干凈并烘干）；氮吹儀，噴燈等

鹽酸（優(yōu)級(jí)純）；無(wú)水醋酸鈉（分析純）；冰醋酸（分析純）；乙腈（色譜純）；去離子水；苯酚（蒸餾）；高純氮?dú)猓兌?9.99%）；冷凍劑（市售食鹽與冰按1：3混合）

色譜柱：Venusil-AA氨基酸分析柱（100Å，4.6mm×250mm ，5μm）

檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：40℃

    流動(dòng)相A：稱(chēng)取15.2g無(wú)水醋酸鈉，加水1850mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH至6.5，然后     

  加乙腈140mL，混勻，用0.45µm濾膜過(guò)濾。

    流動(dòng)相B：80%（V/V）乙腈溶液，進(jìn)樣量：2µL

    流速：1mL/min，梯度洗脫（不同色譜儀器，梯度洗脫條件略有不同，見(jiàn)表1）

1.4.1  0.1mol/L鹽酸溶液：量取9.0mL濃鹽酸，加去離子水稀釋至1000mL。

1.4.2  正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液：稱(chēng)取正亮氨酸約10mg，加0.1mol/L 鹽酸溶液 10mL溶解，混勻。

1.4.3  三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1瓶，加乙腈8.6mL，混勻。

1.4.4  異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2mL，混勻。

1.4.5  6mol/L鹽酸（含0.1%苯酚）：稱(chēng)取苯酚20mg，加濃鹽酸10mL和水10mL溶解，混勻。

1.4.6  混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)液氨基酸濃度見(jiàn)表2）：準(zhǔn)確量取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，置于5mL容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液定容至刻度。（該溶液在4°C可保存2個(gè)月，在-20°C下可保存6個(gè)月）。

1.4.7　異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2mL，混勻。

由于在酸水解過(guò)程中，色氨酸（Trp）幾乎被破壞，因此如需測(cè)定色氨酸，則應(yīng)采用堿水解法來(lái)水解樣品。Venusil-AA氨基酸分析方法包的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中不含有色氨酸，如要測(cè)定色氨酸，需單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)，用前配制。

1.5.1飼料游離氨基酸含量測(cè)定樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量飼料（使樣品中需測(cè)定的單個(gè)氨基酸含量在5～10mg或總氨基酸含量在100-150mg范圍內(nèi)），置于燒杯中，加0.1 mol/L鹽酸30mL，攪拌提取15 min，靜置5分鐘，將上清液過(guò)濾到100 mL容量瓶中，殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸25mL,攪拌3 min，重復(fù)提取兩次，再將上清液過(guò)濾到上述容量瓶中，用水沖洗濾紙上的殘?jiān)?，收集濾液并加0.1mol/L鹽酸定容至刻度，搖勻。

1.5.2 飼料水解氨基酸含量測(cè)定樣品溶液制備

1.5.2.1 酸水解法：

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量樣品，使樣品氨基酸總量在50～75mg范圍內(nèi), 置于20-30mL安瓿瓶中，加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L鹽酸, 振搖使樣品溶解或使樣品均勻分散于溶液中，將安瓿瓶置-20℃冰箱中冷凍3～5min，充氮后用噴燈熔封，然后置110±1℃烘箱中水解24小時(shí), 取出冷卻，打開(kāi)安瓿瓶，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶?jī)?nèi)，用超純水或去離子水定容至刻度，混勻, 供衍生使用。

1.5.2.2 堿水解法：

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量樣品，使樣品氨基酸總量在50～75mg范圍內(nèi)，置于聚四氟乙烯襯管中，加4mol/L氫氧化鋰溶液（稱(chēng)取一水合氫氧化鋰16.78 g ，用水溶解并稀釋至100 mL，使用前取適量超聲或通氮脫氣） 1.50 ml，于液氮中冷凍，而后將襯管插入水解玻管，抽真空至7Pa（≤5Х10-2,mm汞柱），封管。然后，將水解管放入（110士1）℃恒溫干燥箱，水解20小時(shí)。取出水解管，冷至室溫，開(kāi)管，將水解液定量地轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，加入6mol鹽酸溶液1.00 mL中和，并加水定容刻度。用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，取清液貯于冰箱中，供衍生使用。

（注：若樣品顆粒較大，則在稱(chēng)樣前應(yīng)對(duì)樣品粉碎，過(guò)孔徑為0.25mm的樣品篩，并充分混勻。另外若在試樣提取過(guò)程中，過(guò)濾太慢，也可離心10 min （4000 r/min）。

1.5.3  氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的衍生

準(zhǔn)確量取樣品溶液200μl，置1.5ml塑料離心管中，準(zhǔn)確加入20μl正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，用氮吹儀上吹干后，加220μl 0.1mol/L鹽酸溶解，加入三乙胺乙腈溶液100µl，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混勻，室溫放置1小時(shí)，然后加入正己烷400µl，振搖后放置10分鐘，取下層溶液，用0.45µm小濾器過(guò)濾。另準(zhǔn)確量取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液200µl，置一1.5ml塑料離心管中，準(zhǔn)確加入20μl正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，加入三乙胺乙腈溶液100µl，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混勻，室溫放置1小時(shí)，然后加入正己烷400µl，振搖后放置10分鐘，取下層溶液，用0.45µm小濾器過(guò)濾。
 

 

出峰順序：

1 Asp（門(mén)冬氨酸）     2 Glu（谷氨酸）    3 Ser（絲氨酸 ）      4 Gly（甘氨酸 ）    5 His（組氨酸）     

6 Arg （精氨酸）      7 Thr（蘇氨酸）    8 Ala（丙氨酸）       9 Pro（脯氨酸 ）    10 NH₃ （氨）   

11 Tyr（酪氨酸）      12 Val（纈氨酸）   13 Met（蛋氨酸）    14 Cy2（胱氨酸）   15 Ile（異亮氨酸）  16  Leu（亮氨酸）       17 Nle（正亮氨酸）（內(nèi)標(biāo)）      18  Phe（苯丙氨酸）  19  Trp（色氨酸）      20  Lys（賴(lài)氨酸）

專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，包括氨及內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)的20種氨基酸得到*分離，相鄰氨基酸峰之間均達(dá)到基線分離，分離度均大1.5，本方法具有良好的專(zhuān)屬性。

2. 3.1進(jìn)樣重復(fù)性

 

2.3.2衍生重復(fù)性 （同一份樣品重復(fù)衍生6份，分別進(jìn)樣測(cè)定）

 

 

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明：重復(fù)性良好，18種氨基酸保留時(shí)間RSD＜0.2％，各氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值的RSD＜1％，18種氨基酸的衍生重復(fù)性RSD＜1％。 

測(cè)定了市售兔肉肥飼料和益多快長(zhǎng)素飼料，分別酸水解和堿水解后測(cè)定其氨基酸含量，結(jié)果見(jiàn)圖3

   

 

樣品溶液中各種氨基酸濃度（μg/mL） =f₁/f₂×C

其中： f₁=樣品溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積

f₂=混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積

C=氨基酸對(duì)照品濃度（μg/mL）

樣品中總氨基酸含量（％）= 樣品溶液中所有氨基酸濃度總和（μg/mL）×V×10^-6×100 /W
其中： V＝樣品溶液的定容體積（mL）
       W＝樣品質(zhì)量（g）

Venusil AA分析方法使用PITC柱前衍生法測(cè)試氨基酸組成快速、靈敏；衍生方便、快速，衍生物單一、穩(wěn)定，-20°C可貯存數(shù)月；結(jié)果準(zhǔn)確，試劑、副產(chǎn)物、溶劑等多種干擾因素可通過(guò)快速蒸發(fā)去除；紫外檢測(cè)（254mm）靈敏度高；一、二級(jí)氨基酸均可檢測(cè)。本方法測(cè)定飼料中的氨基酸結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于各種品牌的液相色譜儀，值得廣泛推廣。