上海奧法美嘉生物科技有限公司
蛋白質團聚解決方案
檢測樣品：蛋白質 聚集蛋白
檢測項目：大小 濃度
方案概述：以蛋白質溶液為基礎的治療中，團聚可能產生有害的免疫原性。對于較大尺寸的聚集體可以進行測量,但在0.15到2微米范圍內的較小聚集體很難量化。動態(tài)光散射（DLS）技術可以證明聚集體的存在，但不能提供關于聚集體絕對濃度的任何信息。單顆粒光學傳感技術（SPOS）現(xiàn)在可以測量聚集蛋白的大小和濃度,并成為這一應用技術。
生物治療藥物容易誘導抗藥物抗體(ADA)的產生。有證據表明，蛋白質聚集物和顆粒具有增強免疫原性的能力，從而引發(fā)對蛋白質單體形式的免疫反應。
生物治療蛋白的制造商通常通過一系列步驟來制備用于注射的藥物，如:
1.蛋白質合成與純化
2.在運輸過程中用于穩(wěn)定的凍干
3.注射前再造
雖然凍干的好處是它可以穩(wěn)定蛋白質的運輸，但目前還不清楚凍干蛋白在重組后是否會回到單體狀態(tài)。如果由于這一過程而導致少量的蛋白質聚集，就有可能在患者的治療過程中產生免疫反應。
開發(fā)一種簡單的方法來測量聚集程度，使數(shù)據在重組后以大小與濃度的直方圖顯示，將有助于在處方過程中篩選這些藥物。這種分析可以確保重組過程在沒有大量聚集的情況 下釋放單體。
粒子計數(shù)技術
有一些技術能夠測量顆粒大小和濃度的大小范圍的興趣，以量化蛋白質聚集。光阻法是許多藥學工作者所熟悉的方法，因為它是用于USP<788>顆粒物質注射劑和USP< 729> 測試，以測量脂類乳劑的尾部。但是經典的光阻傳感器通常具有更低的粒徑限制，接近1μm,而且對于許多蛋白質聚集樣品，濃度限制太低。
新的PSS AccuSizer FX-Nano系統(tǒng)(如下圖所示)被設計用于更小的顆粒尺寸和更高的濃度。這是通過使用兩個傳感器實現(xiàn)的: FX-Nano傳感器可測量0.15-0.6μm和LE400傳感器測量0.5-40μm。新型FX-Nano傳感器使用聚焦光束來減少檢測的總體積,從而增加了傳感器的濃度限制。該傳感器與SIS進樣器耦合,修改后允許樣品體積低至250μm。這種結構的結膜通過USP <787>治療性蛋白注射中亞可見顆粒物質的所有要求。
聚合蛋白的大小和計數(shù)使用兩個傳感器，以覆蓋0.15- 40um的動態(tài)范圍。當LE傳感器 單獨使用時，可以從0.5 -400 μ m,這使得這個體系非常靈活。
數(shù)據1: IgG過濾前后
在PBS中制備免疫球蛋白G (IgG)， ~ 150kda, 1%。樣品未經稀釋使用賓西澤FX- nano與FX和LE傳感器和SIS進樣器。結果如圖1所示?？傆?粒子計數(shù)= 109,343, 濃度= 9.7 x 10 粒子/毫升。
圖1:未過濾的IgG
樣品還在Particle Sizing Systems Nicomp 380動態(tài)光散射(DLS)系統(tǒng)上進行了分析，如圖2所示,以評估單體的大小，并大致了解聚合蛋白的大小。峰1(天然蛋白):14.6nm(99.6%總質量)。# 2(聚合達到max)：395nm（總質量0.4%）。這是在200-500納米和更大的聚集體的尾部。
圖2：未過濾的1gG的DLS Nicomp 360數(shù)據
然后蛋白樣品通過0.2μm過濾器，在Accuizer FX-Nano系統(tǒng)上再次分析，過濾前后對比結果如圖3所示。PBS的結果也顯示為黑色。
圖3:過濾前(藍色)和過濾后(紅色)
數(shù)據2: 培育前后的IgG
用樣品制備方法研究培育對IgG蛋白樣品的影響。圖4顯示 了IgG樣品在37°C培育前、培育1小時和6小時后的粒徑分布。樣品單獨使用Accuizer FX系統(tǒng)測量。將聚合蛋白定義為>0.7μm, 其濃度分別為9.77、7.75、5.08 x 105顆/毫升。顯然,這種聚集程度隨著熱培養(yǎng)的增加而減少，表明溶解改善。圖5中展開了聚合的尾部以獲得更多細節(jié)。
圖4:時間0(藍色)，1小時(紅色)， 6小時(黑色)
圖5:聚合的蛋白質尾部的擴展視圖
數(shù)據3: 不同貯藏和加工條件下的蛋白質
一名使用者提供了一種未知的蛋白質。在FX-Nano 上分析了緩沖液和三種不同的制備/儲存條件,以確定聚合蛋白的粒徑和濃度。緩沖液和蛋白樣品中> 0.19um顆粒的濃度見表1。圖形結果以差分計數(shù)格式(圖6)和累積格式(圖7)顯示。
表1:緩沖液和三種蛋白樣品的顆粒濃度
圖6:差異分布
圖7:累積分布
圖8和圖9顯示了相同的聚合蛋白數(shù)據，但Y軸的濃度以對數(shù)標度表示，以更好地顯示大濃度范圍的結果。
圖8: Differential distribution, log scale
圖9:Cumulative distribution, log scale
結論：
該Accuizer FX-Nano提供了一種分析工具, 能夠輕松量化蛋白質聚集物的大小和濃度。*的兩個傳感器方法涵蓋了廣泛的動態(tài)范圍，需要提供詳細的，高分辨率的aggre尾部視圖封閉的蛋白質。準確的計數(shù)數(shù)據允許比較不同濃度的樣品的結果。SIS取樣器可以用于此應用所需的小樣本量。此外，通過去除FX-Nano傳感器，該系統(tǒng)可以用于注射中USP <787>和<788>的標準顆粒物。
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