Mycoplasma PCR Detection Kit

支原體PCR檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

●高廣譜性，可檢測(cè)所有可能含有支原體的樣品

●高靈敏度，可檢測(cè)低至10 copies的支原體

●高特異性，真核生物、細(xì)菌的基因組不會(huì)被檢測(cè)

●高保真性，本試劑盒含有陽(yáng)標(biāo)和陰標(biāo)，可有效避免PCR反應(yīng)假陰性和假陽(yáng)性

●操作簡(jiǎn)易，本試劑盒的預(yù)混體系包含PCR反應(yīng)所需試劑

●耗時(shí)短，本試劑盒能夠在2小時(shí)內(nèi)完成支原體檢測(cè)

產(chǎn)品用途  《支原體PCR檢測(cè)試劑盒》可用于檢測(cè)所有可能含有支原體污染的樣品，例如：細(xì)胞培養(yǎng)的上清；血清；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；體液樣品；其他樣品。

產(chǎn)品描述

支原體是最小的原核生物，其大小介于細(xì)菌和病毒之間，約為0.1~0.3μm，且具有變形能力，可透過(guò)常見(jiàn)過(guò)濾膜（0.22~0.45μm），因此常規(guī)的無(wú)菌過(guò)濾方法不能將其去除；無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，常規(guī)抗生素對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)法起到抑制作用；支原體在生長(zhǎng)過(guò)程中是依靠宿主提供營(yíng)養(yǎng)，吸附在細(xì)胞表面或之間，即為細(xì)胞污染物中最為主要的污染。由于支原體會(huì)使宿主細(xì)胞的代謝發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、分化和衰老死亡等現(xiàn)象，所以支原體污染檢測(cè)是細(xì)胞制劑品或細(xì)胞科研的基礎(chǔ)檢測(cè)。支原體PCR檢測(cè)試劑盒是優(yōu)選直擴(kuò)式PCR酶擴(kuò)增支原體基因組中保守16SrDNA而設(shè)計(jì)的，不會(huì)擴(kuò)增細(xì)菌等其他基因組，兼具特異性和高靈敏性的特點(diǎn)，且本試劑盒檢測(cè)范圍廣，可檢測(cè)：(1)M.Hyorhinis，(2)M.Fermentans，(3)M.Arginini，(4)M. hominis，(5)M. orale，(6)M. salivarium，(7)M.pirum，(8)Acholeplasma Laidlawii，(9)M. agalactiae，(10)M.bovis，(11)M. buccale，(12)M. arthritidis，(13)M.pulmonis等幾乎所有常見(jiàn)的污染細(xì)胞的支原體(注：M.為Mycoplasma的縮寫(xiě))。以上13種支原體約占細(xì)胞支原體污染的99%以上。絕大多數(shù)支原體污染集中于前8種。因此非常適合于與細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的科研實(shí)驗(yàn)室及企業(yè)的日常支原體檢測(cè)。
質(zhì)量控制     通過(guò)細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測(cè)。

R R        通過(guò)滲透壓、pH 檢測(cè)。

R R        通過(guò)產(chǎn)品性能檢測(cè)。

使用方法

1.樣品準(zhǔn)備

1.1 收集細(xì)胞培養(yǎng)液1mL，1000rpm離心5min。

1.2 緩慢吸取950µL上清液，13000rpm離心5min。

1.3 棄上清液。緩慢操作，請(qǐng)勿倒置或吸取離心管底部。
注：為增大檢測(cè)靈敏度或減少培養(yǎng)液中的成分對(duì)PCR反應(yīng)的抑制情況，可選擇使用PBS清洗1至2次，13000rpm離心5min，棄上清。

1.4 加入50µL ddH 2 O，混勻后，即為待測(cè)樣品；若當(dāng)日不進(jìn)行檢測(cè)，95℃加熱5min，存放于-20℃保存。

2.實(shí)驗(yàn)環(huán)境消除支原體

2.1 使用75%酒精對(duì)所需實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行擦拭消毒。

2.2 使用去除支原體噴霧進(jìn)行去除支原體，去假陽(yáng)性污染源。

2.3 紫外照射30min，通風(fēng)后方可使用。

3.樣品檢測(cè)

3.1 分別吸取20µL預(yù)混液（PCR Master Mix，含染料，藍(lán)色液體）至0.2mL PCR管中，緩慢加入，防止氣泡產(chǎn)生。

3.2 將待檢測(cè)樣品和陽(yáng)標(biāo)（PCR Positive，紫蓋管）及陰標(biāo)（PCR Negative，白蓋管）分別按需加入預(yù)混體系進(jìn)行支原體檢測(cè)。

注：操作時(shí)產(chǎn)生的微量氣溶膠即可造成樣品之間的相互污染，因此須小心謹(jǐn)慎，避免劇烈操作，為避免陽(yáng)標(biāo)污染，應(yīng)最后添加含陽(yáng)標(biāo)各組。

3.3 建議檢測(cè)體系如下：

注：預(yù)混體系為反應(yīng)優(yōu)化的體系，包含PCR所需的所有試劑，并已添加染料（藍(lán)色），反應(yīng)后可直接進(jìn)行電泳檢測(cè)。待檢測(cè)樣+陽(yáng)標(biāo)反應(yīng)管能夠反映是否PCR反應(yīng)會(huì)被抑制。建議檢測(cè)時(shí)設(shè)置復(fù)孔，復(fù)孔管是為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.4添加所有待檢測(cè)樣品后，振蕩器上混勻，瞬時(shí)離心，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下：

注：反應(yīng)循環(huán)盡量不要超過(guò)35個(gè)，過(guò)多的循環(huán)數(shù)會(huì)造成假陽(yáng)性或雜帶。或執(zhí)行TOUCHDOWN-PCR程序，如下：

4.PCR產(chǎn)物檢測(cè)

4.1 配制1.5%瓊脂糖凝膠，加熱后加入適量GELRED用于紫外燈下顯色。

4.2 吸取5µL PCR反應(yīng)后的樣品進(jìn)行上樣，DNA marker上樣量為5µL。

4.3 電泳條件：電壓為120V，20min左右（可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行時(shí)間調(diào)整）。

4.4 電泳結(jié)束后，置于凝膠成像儀上拍照并保存結(jié)果。

5.結(jié)果分析

本試劑盒中的陽(yáng)標(biāo)大小為700 bp。支原體陽(yáng)性的PCR擴(kuò)增大小為500 bp左右。下圖為使用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果：

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸。-20℃ 儲(chǔ)存，有效期為12個(gè)月。請(qǐng)合理分裝，避免反復(fù)凍融。

特別提醒

? 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)；

? 本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究使用，不得用于臨床診斷；

? 待細(xì)胞培養(yǎng)2~3天后，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度（貼壁細(xì)胞）或密度達(dá)到10 6 /mL（懸浮細(xì)胞）時(shí)取樣進(jìn)行檢測(cè)；

? 預(yù)混體系應(yīng)該在使用前化凍，瞬時(shí)離心后，輕彈混勻；

? 在已滅菌的PCR管中配制反應(yīng)體系，每次實(shí)驗(yàn)均需至少加一個(gè)陰性和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)試反應(yīng)管建議設(shè)置平行對(duì)照；

? 應(yīng)該在專(zhuān)屬區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，避免交叉污染；

? 配制過(guò)程中應(yīng)注意無(wú)菌，戴口罩，并注意避免操作產(chǎn)生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染，推薦在生物安全柜中進(jìn)行操作；

? 加液時(shí)槍頭最好貼著管壁，所有管子用完即蓋，需添加陽(yáng)標(biāo)的各組留在最后，取過(guò)樣品的槍頭用完即棄，盡量減少操作時(shí)污染的可能性；

? 當(dāng)PCR反應(yīng)被強(qiáng)抑制時(shí)（即樣品+陽(yáng)標(biāo)體系無(wú)法獲得陽(yáng)標(biāo)條帶），建議使用PBS清洗，同時(shí)補(bǔ)加2%BSA（需自備）后再進(jìn)行檢測(cè)；

? 本產(chǎn)品的檢測(cè)范圍涵蓋所有支原體種類(lèi)；

? 本產(chǎn)品不會(huì)檢測(cè)真核細(xì)胞和革蘭氏陰性菌的基因組DNA，與支原體親緣較近的革蘭氏陽(yáng)性菌在使用本產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)靈敏度也會(huì)降低10000倍，進(jìn)而減少假陽(yáng)性和提高特異性；

? 檢測(cè)結(jié)果異常時(shí)，建議復(fù)檢；

? 檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性時(shí)，建議繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)7天后，再進(jìn)行復(fù)檢。