1.    技術(shù)簡介

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitativePCR),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR或熒光標(biāo)記的特異性探針，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)在線監(jiān)控PCR反應(yīng)過程，由于在PCR擴(kuò)增基因的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)，可以實(shí)現(xiàn)對目的基因在樣本中的定量。

熒光定量PCR不僅實(shí)現(xiàn)真正實(shí)現(xiàn)了定量，而且具有靈敏度和特異性、高能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。隨著生物芯片技術(shù)和熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)檢測及其他各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景十分廣闊。

2.    方法介紹

根據(jù)Real-time qPCR所使用熒光化學(xué)物質(zhì)有熒光染料和熒光探針兩類，根據(jù)使用熒光物質(zhì)不同，該技術(shù)常用的方法有SYBR Green染料法和TaqMan探針法。

2.1   SYBR Green染料法

目前主要使用的熒光染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I是一種能與DNA雙鏈小溝的特異性結(jié)合染料。游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號(hào)，而結(jié)合雙鏈DNA后，則會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)。在熒光定量PCR擴(kuò)增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn) 物不斷積累，熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)的增加，其熒光信號(hào)強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green I方法是一種最基礎(chǔ)也常用的Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)手段。

熒光染料的優(yōu)點(diǎn)：使用簡便；可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合；價(jià)格便宜

2.2 TaqMan探針法

Real-time qPCR中常用的熒光探針為TaqMan探針，根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成特異性的探針，該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。

正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近，熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí)，引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上，探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq酶利用5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來，從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。

TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：

熒光背景低；

敏感性高；

穩(wěn)定性高；

特異性高。

3.    操作方法

（1）根據(jù)目的基因序列分別設(shè)計(jì)特異性的引物或者熒光探針；

（2）提取各樣本DNA/RNA、RNA反轉(zhuǎn)錄、跑電泳、測濃度；

（3）去基因組DNA，RNA反轉(zhuǎn)錄；

（4）配置PCR反應(yīng)體系，加入模板、引物、染料和dNTP等體系所需的溶液；

（5）      RealTime PCR(熒光定量PCR)擴(kuò)增，

（6）拿到下機(jī)數(shù)據(jù)，進(jìn)行擴(kuò)增曲線、溶解曲線、表達(dá)量差異等分析。