基因敲除原理 我們是利用CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)，CRISPR是一種來源于細菌免疫系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，能精確識別靶細胞DNA片段中靶點的核苷酸序列，利用核酸內(nèi)切酶蛋白對DNA靶點序列進行切割，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，斷裂將在體內(nèi)被細胞修復(fù)機制修復(fù)，其中，非同源末端連接NHEJ這種修復(fù)將產(chǎn)生短的核酸插入或刪除，其帶來的基因移碼突變，將導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼子，從而完成對靶細胞DNA目的基因片段的敲除。在PAM片段上游設(shè)計sgRNA后，通過構(gòu)建基因敲除載體，結(jié)合慢病毒系統(tǒng)，可以實現(xiàn)外源基因的整合，利用抗生素或熒光，最終篩選出成功實現(xiàn)基因敲除的細胞。 CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)服務(wù)優(yōu)勢： （1）廣泛適用于哺乳動物細胞，脫靶率更低 （2）提高轉(zhuǎn)染率，減低細胞毒性，縮短實驗周期 基因敲除細胞株的項目流程： （1）項目評估（免費） （2）細胞抗生素敏感濃度摸索與單克隆形成驗證 （3）sgRNA設(shè)計與敲除載體構(gòu)建 （4）慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染 （5）陽性多克隆篩選 （6）陽性單克隆篩選 （7）敲除驗證 基因敲除服務(wù)周期：根據(jù)細胞生長特性與基因不同，服務(wù)周期在5～10周不等。 服務(wù)流程：                      客戶提供：靶細胞及其培養(yǎng)方案、基因名稱 交付標(biāo)準：1×基因敲除陽性單克隆細胞株（復(fù)蘇）                   1×項目結(jié)題報告 服務(wù)保證： （1）項目啟動后，密切跟進實驗進展，每兩周進行一次項目進度匯報。 （2）項目結(jié)題報告包含sgRNA序列、實驗詳細記錄、測序結(jié)果及分析等，滿足客戶后期論證材料需求。 （3）基因敲除陽性單克隆均經(jīng)過靶標(biāo)片段T載體克隆測序驗證，保證基因敲除。 【案例分享】CRISPR/Cas9基因敲除細胞株構(gòu)建 1 抗生素敏感濃度摸索?? 將細胞如下圖1稀釋。給藥7天后，棄培養(yǎng)液，用臺盼藍染色2 min，顯微鏡下觀察細胞存活情況。確定細胞多克隆細胞篩選和單克隆細胞篩選濃度。                                       圖1 抗性濃度摸索 2 單克隆形成驗證 細胞計數(shù)，將細胞懸液稀釋混勻后加入96孔板，用封口膠將孔板封好，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)48 h后每日觀察并記錄單克隆形成情況。 3 靶標(biāo)基因sgRNA 設(shè)計 根據(jù)基因序列信息，設(shè)計 sgRNA。 4 位點序列信息確認 PCR擴增（圖2），測序驗證基因序列，以確定sgRNA區(qū)域有無SNP。                                 圖2 靶標(biāo)序列擴增 5 敲除載體構(gòu)建 退火，連接，轉(zhuǎn)化，涂板（LB/Amp）培養(yǎng)。 每個實驗組各挑取6個單克隆菌落，于LB/ Amp培養(yǎng)基中擴增，提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒提取效果（圖3）。                                             圖3 質(zhì)粒抽提 酶切驗證 ：取3個單克隆酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果（圖4）。選擇2個樣品送樣測序。                                圖4 單克隆酶切驗證 6 慢病毒包裝 敲除載體無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，病毒包裝。 7 細胞轉(zhuǎn)染 配制梯度病毒稀釋液，細胞于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h。 8 陽性多克隆細胞株篩選 9 陽性單克隆細胞株篩選 細胞轉(zhuǎn)染48h后，更換培養(yǎng)基，篩選至對照組大部分細胞死亡，實驗組細胞擴大培養(yǎng)，進行單克隆篩選。幾天后挑選陽性單克隆進行擴增，并取樣驗證。  10 陽性單克隆細胞株驗證 1、測序驗證 提取陽性單克隆細胞株的基因組，將靶標(biāo)基因酶切克隆至T載體后測序，以確定是否敲除成功。 實驗結(jié)果示例： 該基因有兩個單克隆細胞株，A1和A2。 單克隆細胞A1的目的基因在sgRNA2位置出現(xiàn)兩種突變形式，分別缺失1個和19個堿基，在新序列的第337位和第355位堿基提前出現(xiàn)終止密碼子。 單克隆細胞A2的目的基因在sgRNA2位置發(fā)生突變，插入1個堿基，在新序列的第340位堿基提前出現(xiàn)終止密碼子。
產(chǎn)品規(guī)格：T25培養(yǎng)瓶/凍存管 細胞數(shù)量1x10^6
運輸方式：常溫運輸/干冰運輸 用途限制：僅供科研
細胞接收后處理： 收到細胞后，及時核對培養(yǎng)瓶/凍存管上標(biāo)注的細胞名稱是否正確，以及培養(yǎng)瓶是否有破損或漏液等異常情況。如發(fā)現(xiàn)問題請及時與銷售聯(lián)系。 收到常溫運輸?shù)募毎囵B(yǎng)瓶后，請在顯微鏡下仔細觀察細胞生長狀態(tài)，并拍照留證（為細胞售后提供依據(jù)）。將培養(yǎng)瓶放置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細胞融合度為70%~80%狀態(tài)再進行細胞處理。（注：運輸過程易導(dǎo)致部分細胞脫落，漂浮，屬正?，F(xiàn)象，放置培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，可使其貼壁；另。請使用新鮮培養(yǎng)基和新的T53培養(yǎng)瓶進行細胞傳代，不要使用原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。 收到凍存細胞應(yīng)立即復(fù)蘇或放置液氮罐中。 收到復(fù)蘇好后的細胞一周內(nèi)，如若發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)不佳或細胞污染，請及時與銷售聯(lián)系，并提供該細胞詳細的實驗操作說明和每天細胞狀態(tài)的圖片記錄（填寫【細胞售后反饋表】），經(jīng)由我司技術(shù)人員核實，若確認細胞本身存在問題，由我司重新復(fù)蘇細胞并補發(fā)。

公司簡介

廣州艾迪基因科技有限責(zé)任公司由多名留學(xué)歸國博士和生物科技領(lǐng)域精英聯(lián)合創(chuàng)建，坐落于廣州產(chǎn)業(yè)示范基地——科學(xué)城。作為基因編輯/細胞單克隆專家，公司專注于發(fā)展和優(yōu)化基于CRISPR/Cas的基因組編輯技術(shù)，依托*單克隆打印平臺，為用戶提供高質(zhì)量的技術(shù)服務(wù)和基因編輯產(chǎn)品。
        我們堅守“以客戶為中心、以奮斗者為本”的原則，秉承“創(chuàng)新、共享”的發(fā)展理念，以達到客戶對“產(chǎn)品質(zhì)量的滿意，*技術(shù)的滿意，售后服務(wù)的滿意 ”為目標(biāo)，確保每一位用戶都能獲得更的體驗。