PCR原理及故障維修電話(huà)擴(kuò)增的原理和操作步驟（一）

Thermo PCR擴(kuò)增反應(yīng)的操作

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1   Thermo PCR擴(kuò)增反應(yīng)的基本原理

一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基本構(gòu)成

PCR原理及故障維修電話(huà)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡(jiǎn)稱(chēng)，指在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定模板(克隆或基因組DNA)的擴(kuò)增反應(yīng)，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，在體外特異性擴(kuò)增DNA pian段的一種技術(shù)，在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用，包括用于DNA作圖、DNA測(cè)序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等。

 Thermo PCR基本原理: 是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3'末端有引物存在的情況下，用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴(kuò)增。在微量離心管中，加入與待擴(kuò)增的DNA pian段兩端已知序列分別互補(bǔ)的兩個(gè)引物、適量的緩沖液、微量的

2+DNA膜板、四種dNTP溶液、耐熱Taq DNA聚合酶、Mg等。反應(yīng)時(shí)先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開(kāi)為單鏈狀態(tài);然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對(duì)，形成部分雙鏈，稱(chēng)為退火;再將溫度升至合適溫度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP為原料，引物沿5'?3'方向延伸，形成新的DNA 段，該片段又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此重復(fù)改變溫度，由高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸組成一個(gè)周期，反復(fù)循環(huán)，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。因此PCR循環(huán)過(guò)程為三部分構(gòu)成:模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA聚合酶在適當(dāng)溫度下催化DNA鏈延伸合成(見(jiàn)圖)。

1(模板DNA的變性

模板DNA加熱到90~95?時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，雙鏈解開(kāi)成為單鏈，稱(chēng)為DNA的變

G-C間由三個(gè)性，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。變性溫度與DNA中G-C含量有關(guān)，氫鍵連接，而A-T間只有兩個(gè)氫鍵相連，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對(duì)要高些。故PCR中DNA變性需要的溫度和時(shí)間與模板DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、G-C含量高低等均有關(guān)。對(duì)于高G-C含量的模板DNA在實(shí)驗(yàn)中需添加一定量二甲基亞砜(DMSO)，并且在PCR循環(huán)中起始階段熱變性溫度可以采用97?，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，即所謂的熱啟動(dòng)。

2(模板DNA與引物的退火

將反應(yīng)混合物溫度降低至37~65?時(shí)，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復(fù)合物。退火所需要的溫度和時(shí)間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并由于引物的長(zhǎng)度顯著短于模板的長(zhǎng)度，因此在退火時(shí)，引物與模板中的互補(bǔ)序列的配對(duì)速度比模板之間重新配對(duì)成雙鏈的速度要快得多，退火時(shí)間一般為1,2min。

3(引物的延伸

DNA模板-引物復(fù)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的新鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。延伸所需要的時(shí)間取決于模板DNA的長(zhǎng)度。在72?條件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40,60個(gè)堿基/秒。經(jīng)過(guò)一輪“變性-退火-延伸”循環(huán)，模板拷貝數(shù)增加了一倍。在以后的循環(huán)中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一輪循環(huán)以后，DNA拷貝數(shù)就增加一倍。每完成一個(gè)循環(huán)需2,4min，一次PCR經(jīng)過(guò)30,40次循環(huán)，約2,3h。擴(kuò)增初期，擴(kuò)增的量呈直線(xiàn)上升，但是當(dāng)引物、模板、聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，便出現(xiàn)所謂的“平臺(tái)效應(yīng)”，即靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加。

Thermo PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)終的DNA擴(kuò)增量可用Y

n,(1，X)計(jì)算。Y代表DNA pian段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，

靶序列DNA pian段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA pian段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線(xiàn)性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱(chēng)平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類(lèi)和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。

Thermo PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5'端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在di一個(gè)反應(yīng)周期中，以?xún)蓷l互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3'端開(kāi)始延伸，其5'端是固定的，3'端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以?xún)?nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA pian段供分析與檢測(cè)用。

變性

退火

延伸

圖 Thermo PCR的反應(yīng)歷程