北京ELISA檢測試劑盒，大鼠糖原磷酸化酶同工酶BB(GP-BB)ELISA Kit供應廠家

參數(shù)規(guī)格：

【規(guī)格】：96T/48T

【標本】：血清、血漿、細胞上清液、尿液、體液、灌洗液、腦脊髓、心房水、胸房水、組織等。

【特點】：專一性強、靈敏度高、樣品易保存、結果易觀察、可以定量測定、可以大規(guī)模測定樣品、儀器和試劑簡單。

【運輸】：快遞(根據(jù)客戶要求，選擇具體的運輸方式)

操作流程：

1. 實驗前標準品、試劑及樣本的準備；

2. 加樣（標準品及樣本）100μL，37°C孵育1小時；

3. 吸棄，加檢測溶液A100μL，37°C孵育1小時；

4. 洗板3次；

5. 加檢測溶液B100μL，37°C孵育30分鐘；

6. 洗板5次；

7. 加TMB底物90μL，37°C孵育15－25分鐘；

8. 加終止液50μL，立即450nm讀數(shù)。

工作原理：

將轉化生長因子β2 (TGFb2)抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中的轉化生長因子β2 (TGFb2)與連接于固相載體上的抗體結合，然后加入生物素化的轉化生長因子β2 (TGFb2)抗體，將未結合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標記的親和素，再次*洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的轉化生長因子β2 (TGFb2)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(O.D.值)，計算樣品濃度。

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使用方法：

1、 血清：操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細胞迅速小心地分離。

2、 血漿：EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、 細胞上清液：1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、 組織勻漿：將組織加入適量鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。

5、 保存：如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

ELISA標準操作及技術服務的常見問題分析：

一.ELISA 標準操作要點

優(yōu)質的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的本公司要求使用的純化水電導率小于1.5μs/cm。

1. 標本的采取和保存

大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。一般說來，在5 天內測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。抗凝不*的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。

2.加樣

加樣時應將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

3.保溫

在建立ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經

1-2 小時，產物的生成可達。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結果，將質控放在非邊緣位置。

4.洗滌

洗滌在ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。

洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。

洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應按要求稀釋，所用的水電導率在1.5us/cm 之下，洗液如果結晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡。

5. 顯色和比色

TMB 經HRP 作用后，約40 分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2 小時后即可*消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24 小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指于測讀ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30 分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。

測讀A 值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不 移動ELISA 板的位置，zui終測得的A 值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

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