10912ES10 多片段一步法快速克隆試劑盒
- 公司名稱 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
- 品牌 Yeasen/翌圣生物
- 型號 10912ES10
- 產(chǎn)地 上海
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時間 2025/2/7 13:39:41
- 訪問次數(shù) 3667
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企業(yè)簡介
翌圣生物科技（上海）股份有限公司【Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.】是一家以蛋白質(zhì)改造和酶進化技術為驅(qū)動，聚焦生命科學產(chǎn)業(yè)鏈上游核心原料，從事分子、蛋白和細胞三大品類生物試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與銷售的高新技術企業(yè)，通過打通分子酶、蛋白、抗體、核酸、細胞的技術開發(fā)路徑，成為國內(nèi)少數(shù)同時覆蓋三大品類生物試劑、兼?zhèn)浜诵募夹g自主研發(fā)能力和規(guī)?；a(chǎn)能力的高新技術企業(yè)，產(chǎn)品廣泛應用于生命科學研究領域、診斷與檢測領域和生物醫(yī)藥領域。
主營業(yè)務
公司憑借在蛋白質(zhì)改造和酶進化領域的技術優(yōu)勢和深耕生物試劑行業(yè)多年積累的豐富經(jīng)驗，構建了品質(zhì)優(yōu)良、類型齊全、種類豐富的產(chǎn)品管線。自公司成立以來，公司研發(fā)、生產(chǎn)和銷售的生物試劑超過3000種，涵蓋分子、蛋白、細胞三大品類的生物試劑，能夠滿足客戶多種類型生物試劑的一體化采購需求。公司核心產(chǎn)品覆蓋qPCR系列、NGS系列、逆轉(zhuǎn)錄系列、核酸提取與純化系列、PCR系列、分子克隆系列、體外轉(zhuǎn)錄系列、抗體、蛋白純化系列、蛋白分析系列、重組蛋白、細胞分析系列、細胞培養(yǎng)系列、細胞轉(zhuǎn)染系列、報告基因檢測系列等多個品類的生物試劑，廣泛應用于生命科學研究、診斷檢測和生物醫(yī)藥等領域。
發(fā)展歷程
榮譽資質(zhì)
翌圣生物通過申請商標和軟件著作權的方式保障核心技術和市場競爭力，不斷加強公司品牌建設。截至2022年3月31日，公司已經(jīng)獲得授權18項（其中發(fā)明14項、實用新型1項、外觀設計3項）和45項與生物試劑相關的軟件著作權，擁有經(jīng)國家知識產(chǎn)權局商標局核準的注冊商標權37項以及4項境外注冊商標，是國家高新技術企業(yè)和上海市專精特新企業(yè)。
創(chuàng)新平臺
經(jīng)過多年的產(chǎn)品研發(fā)技術經(jīng)驗的沉淀以及持續(xù)的研發(fā)創(chuàng)新，翌圣生物積極開展“產(chǎn)學研”合作，與擁有生物催化與酶領域國家重點實驗室的湖北大學、擁有教育部工業(yè)生物領域重點研究基地的江南大學展開合作，優(yōu)化生物試劑關鍵原料的生產(chǎn)和表達工藝。翌圣生物以基因工程技術、生物信息技術、細胞生物學技術、免疫學技術、生化分析技術等生命科學領域的共性生物技術為基礎，建立了六大核心技術平臺——雙向分子酶理性設計與定向進化平臺、密度發(fā)酵與超潔凈純化平臺、分子診斷試劑關鍵原料研發(fā)平臺、高通量測序建庫試劑創(chuàng)新研發(fā)平臺、高性能單克隆抗體研發(fā)平臺和mRNA醫(yī)藥應用研發(fā)平臺，目前已經(jīng)自主研發(fā)出20項核心技術，打通分子酶、蛋白、抗體、核酸、細胞的技術開發(fā)路徑，覆蓋技術研發(fā)、產(chǎn)品升級、規(guī)模生產(chǎn)和質(zhì)量控制等生物試劑研發(fā)和生產(chǎn)的各關鍵環(huán)節(jié)。
工業(yè)化生產(chǎn)
翌圣生物擁有按照準GMP 標準建設運營的工業(yè)化生產(chǎn)基地，配有噸級發(fā)酵線、工業(yè)級 AKTA 純化線和全自動包裝線。同時，公司通過了ISO 13485:2016質(zhì)量管理體系認證，從原料控制、生產(chǎn)管理、質(zhì)檢管控、倉儲運輸?shù)葘ιa(chǎn)線進行360度管理監(jiān)督，保證產(chǎn)品過程的可控制性及可追溯性，竭盡全力為您提供可靠的產(chǎn)品。
客戶服務
翌圣生物憑借優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量、高效及時的響應能力、快速穩(wěn)定的交付能力和周到完備的售后服務獲得了眾多科研用戶和工業(yè)用戶的認可，為檢測公司、治療公司、工具類公司和科學研究實驗室提供應用于科學研究、體外診斷、基因測序、生物醫(yī)藥等的生物試劑。與中國科學院、清華大學、北京大學、復旦大學、上海交通大學、浙江大學等頂尖科研院所和華大基因、恒瑞醫(yī)藥、藥明康德、之江生物、圣湘生物、斯微生物、金斯瑞、思路迪等工業(yè)客戶建立了穩(wěn)定、緊密的合作關系，公司產(chǎn)品被多次使用在Nature、Science、Cell等國際頂級期刊論文發(fā)表中。
公司企業(yè)文化
幫助客戶創(chuàng)造價值，讓世界更健康更快樂
◎ 成為生命科學工具領域全球Top⑩
◎ 具備驅(qū)動產(chǎn)業(yè)變革的技術創(chuàng)新能力
◎ 擁有一支持續(xù)學習型的翌圣鐵軍
翌圣生物始終秉承“幫助客戶創(chuàng)造價值，讓世界更健康更快樂”的使命，專注于技術創(chuàng)新和產(chǎn)品升級，不斷拓展核心技術的應用領域，為客戶提供更為的產(chǎn)品與服務，助力我國打造自主可控的生物試劑產(chǎn)業(yè)鏈。同時，翌圣生物將進一步推進國際化戰(zhàn)略，繼續(xù)布局和拓展海外市場，為全球生物試劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展貢獻力量。
分子生物學試劑，細胞生物學試劑，免疫學試劑，蛋白組學試劑等
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 10 T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 10912ES10 | 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 儲存 | 價格（元） | *（元） |
Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆試劑盒 | 10912ES10 | 10 T | -20℃ | 457.00 |
Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit是一款簡便、快速、高效的DNA定向克隆產(chǎn)品，該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應20 min即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。克隆陽性率可達95%以上。
試劑盒中2×Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix預混了重組酶和重組反應所需緩沖液，并添加了*的重組增強因子，可顯著提高重組克隆效率。使用該試劑盒，可以一次實現(xiàn)多至5個片段的順序拼接克隆。
產(chǎn)品組分
編號 | 組分 | 10912ES10 (10 T) |
10912-A | 2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix | 100 μL |
10912-B | 500 bp Control Insert (25 ng/μL) | 5 μL |
10912-C | pUC 19 Control Vector, linearized (50 ng/μL) | 5 μL |
快速克隆；定向克??；定點突變。
運輸與保存方法
冰袋運輸。-20℃保存，有效期1年。
注意事項
1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
2）本產(chǎn)品僅作科研用途！
實驗流程
① 載體線性化：酶切或反向PCR制備線性化載體。
② 插入片段的制備：由PCR制備，所用擴增引物在設計時需在其5’端添加同源序列（圖中以紅色、黃色、紫色和綠色標記)，使得擴增產(chǎn)物之間以及擴增產(chǎn)物與線性化載體之間各有一段同源序列。
一. 制備線性化載體
選擇合適的克隆位點，并對載體進行線性化。建議盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區(qū)域進行克隆。載體克隆位點上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)最佳。線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切或反向PCR擴增獲得。
1.酶切制備線性化載體
1）雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景低。建議使用。
2）單酶切線性化：線性化程度較差?？蛇m當延長酶切時間以降低轉(zhuǎn)化背景。
【注】：不含插入片段的假陽性克隆是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。若這種假陽性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。
2.反向PCR擴增制備線性化載體
建議使用高保真聚合酶（如：Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）進行載體擴增，以減少擴增突變的引入。PCR擴增模板應盡量使用預線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對克隆陽性率的影響。
Hieff Clone®重組反應體系兼容幾乎所有酶切反應體系和常規(guī)PCR反應體系，當載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴增產(chǎn)物純度較高時，可以無需純化，直接進行重組反應。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對線性化載體進行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。
二. PCR擴增制備插入片段
1.設計擴增引物
Hieff Clone® 引物設計方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。
推薦使用翌圣無縫克隆引物設計軟件（122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動生成插入片段的擴增引物。若手動設計，可參照以下實例。以在pUC18載體（注：與該試劑盒中提供的C組分不同，C組分為pUC19）的EcoR I 和Hind III 酶切位點間插入三段基因的引物設計為例，引物具體設計方案如下：
首先設計第一片段的正向擴增引物和第三片段的反向擴增引物(與載體相鄰的兩個插入片段)。
第一片段正向擴增引物設計方式：
5’—上游載體末端同源序列+酶切位點（可保留或刪除）+第一片段基因特異性正向擴增序列—3’
第三片段反向擴增引物設計方式：
3’—第三片段基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’
【注】：
① 基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列；
② 上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。
其次設計第一片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物。用于片段之間進行重組的同源序列可以添加至前方片段的反向擴增引物中，也可以添加至后方片段的正向擴增引物中，還可以兩片段各添加一部分。以將同源序列添加至前方片段 （第一片段）的反向擴增引物中為例，引物具體設計方案如圖3所示：
第一片段反向擴增引物設計方式：
3’—第一片段基因特異性反向擴增序列+第二片段5’端同源序列—5’
第二片段正向擴增引物設計方式：
5’—第二片段基因特異性正向擴增序列—3’
【注】：
① 基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列；
② 第二片段5’端同源序列即用于第一片段與第二片段進行重組的添加序列。
最后設計第二片段的反向擴增引物和第三片段的正向擴增引物。設計方式與第一片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物設計方式一致。 
【注】：最終引物長度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進行引物合成。計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，載體末端同源序列不應參與計算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。
2.插入片段PCR擴增
插入片段擴增可用任意PCR酶擴增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。但為了減少擴增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進行擴增（Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）。
PCR擴增結束后，取少量產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗擴增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone®重組反應體系兼容常規(guī)PCR反應體系。因此，如果擴增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴增產(chǎn)物可以無需純化，直接用于重組反應。但PCR擴增產(chǎn)物純度較低時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物進行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。
三. 線性化載體與插入片段濃度測定
推薦使用瓊脂糖凝膠電泳比較條帶亮度的方法對DNA進行定量。將線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物做數(shù)個等體積稀釋梯度，原始產(chǎn)物和稀釋后產(chǎn)物各取1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標準（DNA Marker）比較條帶亮度以確定其近似濃度。
四. 重組反應
1. 線性化載體與插入片段使用量計算
Hieff Clone® Plus Multi重組反應體系最適DNA使用量為每片段（包括線性化載體）0.03 pmoL。該摩爾數(shù)對應的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計算獲得：
每片段最適使用量= [0.02×載體堿基對數(shù)]ng (0.03 pmoL)
例如，將長度為0.5kb、1kb、2 kb三插入片段克隆至長度為5 kb的載體時，各片段最適使用量應為：
線性化載體最適使用量：0.02 × 5000 = 100 ng；
0.5kb插入片段最適使用量應為：0.02 × 500 = 10 ng；
1 kb插入片段最適使用量應為：0.02 × 1000 = 20 ng；
2 kb插入片段最適使用量應為：0.02 × 2000 = 40 ng。
【注】：
1）插入片段DNA使用量應大于10 ng。當使用上述公式計算DNA最適使用量低于這個值時，直接使用10 ng即可。
2）線性化載體的使用量應在50-200 ng之間。當使用上述公式計算最適使用量超出這個范圍時，則選擇低或高使用量即可。
3）線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。
2.反應體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）
組分 | 重組反應 | 陰性對照-1 | 陰性對照-2 | 陽性對照 |
ddH2O | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL |
2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix | 10 μL | 0 μL | 0 μL | 10 μL |
線性化載體 | X μL | X μL | 0 μL | 1 μL |
N個插入片段 | Y μL | 0 μL | Y μL | 1 μL |
【注】：
1）X和Y分別是根據(jù)公式計算得到線性化載體和插入片段用量。
2）陰性對照-1可用來確認線性化載體有無環(huán)狀質(zhì)粒殘留，可選擇性進行。
3）當插入片段擴增模板是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒時，可用陰性對照-2來確認有無環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留，可選擇性進行。
4）試劑盒中提供陽性對照反應所需組分（B組分和C組分），可用來排除其他實驗材料及操作因素的影響，可選擇性進行。
3.重組反應
1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應液收集至管底。
2）置于50℃反應20 -50 min。當插入片段總和＞5 kb時，建議提高孵育時間到30-50 min可以增大重組效率。
注：建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進行反應。
3）待反應完成后，建議將反應管置于冰上冷卻5 min，以防溫度過高降低感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。
4）反應產(chǎn)物可直接進行轉(zhuǎn)化，也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉(zhuǎn)化。
五. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板
1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat No. 11802ES）。
2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。
3）42℃熱激90秒，冰浴孵育2 min。
4）加入900 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10 min充分復蘇。37℃，200 rpm，搖菌45 min。
5）5000 rpm離心3 min，棄掉900 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。
六. 克隆鑒定
方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測序引物進行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽性的產(chǎn)生。后續(xù)也可做酶切或測序鑒定。
應用實例
圖4. Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit進行三片段克隆。
A：重組轉(zhuǎn)化平板。B：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。C：PCR方法鑒定每個單片段和最終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重組反應條件：50℃，20 min。
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