選擇一種恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒是影響基因表達的關(guān)鍵因素。請看牛流行性腹瀉病毒PCR-熒光探針試劑盒嘗試利用10種不同的質(zhì)粒構(gòu)建成的融合質(zhì)粒表達相同的蟲熒光素酶報告基因，這10種融合質(zhì)粒表達出的蟲熒光素酶基因的表達水平各異。ELISA試劑盒告訴您影響基因表達的質(zhì)粒因素。蟲熒光素酶報告基因表達水平依賴于空載質(zhì)粒的類型。以上是蟲熒光素酶報告基因在THP1和HUVEC細胞中在4小時、24小時和48小時中的表達水平。在THP1細胞中，質(zhì)粒DNA的量為0.3-0.5μg。HUVEC細胞中質(zhì)粒DNA的量為2.5-4.4μg。
啟動子的類型是否適用于現(xiàn)在的細胞類型？ELISA試劑盒展示了在不同的細胞類型中啟動子的強度時不同的。盡管CMV在大多數(shù)哺乳動物細胞中屬于較強的啟動子，但是另外的啟動子可能會在我們研究的這種細胞中有較強的表達(例如BHK-21細胞中SV40啟動子)。
內(nèi)含子
的基因表達需要基本的內(nèi)含子的剪切，然而牛流行性腹瀉病毒PCR-熒光探針試劑盒這個觀點并不是總被大家認可。內(nèi)含子的位置和強度會影響轉(zhuǎn)錄、mRNA的輸出和聚腺苷酸化。這樣，依賴于內(nèi)含子的位置，內(nèi)含子甚至?xí)?dǎo)致基因表達的降解。
IRES(內(nèi)部核糖體進入位點)
內(nèi)核糖體剪切位點質(zhì)粒，啟動子驅(qū)動兩種基因的表達，一個是感興趣的克隆基因(經(jīng)常是處在上游基因)，另一個是報告基因，通常編碼GFP蛋白。IRES質(zhì)粒表達的mRNA是雙順反子信使，意味著兩個基因都在相同的mRNA分子上。兩種基因的雙順反子數(shù)量是一樣的，但是兩種基因的翻譯起始水平存在極大的不同。核糖體結(jié)合上游基因的起始位點是相當(dāng)有效的，然而IRES卻會讓核糖體與下游基因的結(jié)合和翻譯處于一個較低的水平。下游基因通常是GFP，因此GFP的表達水平就會低于沒有IRES序列的質(zhì)粒表達。而通常沒有IRES序列的GFP質(zhì)粒的表達水平我們認為是正常的。可以通過構(gòu)建兩種基因的融合質(zhì)?；蛘吖厕D(zhuǎn)染實現(xiàn)表達相同數(shù)量的感興趣的蛋白和GFP蛋白。
ELISA試劑盒質(zhì)粒的大小在實驗室中我們通常會使用4-7kb的質(zhì)粒，而Lonza的Nucleofection可以轉(zhuǎn)染長至20kb的質(zhì)粒。若是更長的質(zhì)?？赡軙?dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的降低。通常的規(guī)則是，牛流行性腹瀉病毒PCR-熒光探針試劑盒質(zhì)粒長度越長，越難進入到細胞內(nèi)。這個規(guī)則適用于電穿孔的方法以及脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法。